2016 Fiscal Year Research-status Report
DNA相同組換えタンパク質Rad52の非相同末端結合での働き
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16K07258
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
新井 直人 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (70297795)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | DNA末端結合 / Rad52 / 相同組換え / 非相同末端結合 / Rad51 / DNA二本鎖切断 / DNA修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
出芽酵母のRad52は、相同組換えだけでなく非相同末端結合への関与も示唆された。試験管内で直鎖状DNAはDNAリガーゼによりDNA分子内で末端が結合し環状となるが、Rad52の存在下では直鎖状DNAが分子間で連結した多量体となりDNA連結も促進された。平成28年度は以下の2点に焦点を当てた。1、Rad52によるDNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成が同じ分子機構に由来するのか。2、Rad52のどの領域が機能しているのか。
まず、Rad52によるDNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成について至適条件を決定した。Rad52の至適濃度は狭い領域にあり過剰量では阻害された。PEGによりDNAリガーゼ活性は促進されたが、Rad52活性の促進効果は認められなかった。Rad52（全長34-504アミノ酸）の重要領域を特定するために以下の8種類の変異体を用いた解析を行った。C末側欠失変異：Δ238-504、Δ328-504、Δ457-504。N末側欠失変異：Δ34-237、Δ34-357、Δ34-456。N末側DNA結合欠損変異：K117A/R148A。Rad51との結合欠損変異：F349A/Δ409-412。その結果、Rad51との結合領域とN末側DNA結合部位は影響しなかったが、N末端側またはC末端側だけでは不十分であり両方が必要であった。C末側の457-504アミノ酸領域にDNA結合部位があることを突き止め、分子生物学会年会で報告した。そしてこの領域を欠失すると活性が顕著に低下し、重要な役割をしていることが示された。これらの解析を通していくつかの反応条件を検討し、使用したRad52変異にもDNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成を分離するような変異はなく常に連動していることから、DNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成は関連していると考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
出芽酵母のRad52による非相同末端結合への関与について、平成28年度の計画では、1「Rad52のDNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成が同じ分子機構に由来するのか」、2「Rad52のC末側のどの領域が機能しているのか」の2点に着目して試験管内での反応を中心に解析を行うことであった。まず、試験管内でDNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成の至適条件を決定できた。また、解析した8種類のRad52変異体のうち、これまで精製を終えていた6種類に加えて、C末側の欠失変異を2種類（Δ328-504、Δ457-504）構築し大腸菌で発現し精製して解析を行った。C末側の457-504領域にDNA結合領域があることを見つけ、さらに絞り込んで475-504領域の合成ペプチドがDNAに結合することが示された。この457-504のDNA結合領域は、Rad52の機能に重要な役割をしていた。即ち、DNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成だけでなく、相同組換えの相同対合（D-loop形成）にも関与し、さらにその領域を欠失したRad52Δ457-504を発現した出芽酵母ではDNA修復能力が低下することが示された。これまでRad52のN末側のDNA結合部位の重要性は示されてきたが、C末側のDNA結合部位の必要性は見逃されてきた。従って、C末側のDNA結合領域の決定と機能の一部の解明は今後のRad52の非相同末端結合と相同組換えの機能解明に新たな展開をもたらすものと考えている。一方、これまで使用したRad52変異にはDNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成を分離するような変異はなく、分離できる反応条件もなかったことから両活性は関連していると考えている。以上のように研究は予定どおりに進行し、C末側のDNA結合領域特定という新たな発見もあった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は当初の計画に従って以下の2項目について推進する：3、Rad51とRad52による直鎖状DNA多量体形成の活性に関連性はあるのか。4、出芽酵母内での非相同末端結合に、Rad52のDNA末端連結促進と直鎖状DNA多量体形成が直接的に機能しているのか。
これまでの予備的な実験からRad51とRad52の両者とも試験管内でDNA末端連結促進と直鎖状DNA多量体形成を行うが、至適条件が異なる点、両者を同時に加えると活性促進が見られない点から別々の反応機構によるものと推測している。しかし、両者は複合体を形成するため、単独の機能と複合体での機能は異なる可能性がある。これまで所有しているRad51およびRad52の変異体を組み合わせながら、Rad51とRad52の単独での機構の違い、複合体での機構との関連を生化学的解析により明らかにしていきたいと計画している。
一方、出芽酵母内でRad52が非相同末端結合に関連しているのか、試験管内での活性との関連についての解析するために、現在RAD52遺伝子の翻訳領域を完全に欠失した出芽酵母株の作成を進行中である。現在所有しているrad52欠損株は、RAD52遺伝子の翻訳領域の一部がゲノム内に残っているためその影響を完全になくすためである。また、rad52変異をプラスミド上で強制的に発現する場合と、ゲノムに組込んで野生型プロモーターで発現する場合の両方から解析を行う予定である。Rad52のC末端側のDNA結合に関与する領域を狭め、関連アミノ酸まで同定できるように複数のrad52C末側のDNA結合欠損変異の導入も始めた。
以上のようにDNA末端結合についてRad52とRad51の関連性、Rad52によるDNA修復についてDNA末端結合と相同組換えの関連も含めて試験管内と細胞内の両面から推進していく計画である。
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Research Products
(6 results)
