2016 Fiscal Year Research-status Report
酸化損傷ｍＲＮＡによる遺伝子発現異常を抑制する機構の解明
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16K07260
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| Research Institution | Fukuoka Dental College |
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Principal Investigator |
石井 健士 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 講師 (70516731)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
関口 猛 九州大学, 医学研究院, 助教 (60187846)
早川 浩 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 教授 (70150422)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 酸化ストレス / mRNA分解 / AUF1 / 老化 / 疾患 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
mRNAが酸化損傷を受けると異常タンパク質の合成が起こり、遺伝情報の誤伝達が引き起こされる。その結果、細胞機能の喪失が誘導され、細胞に深刻な障害を与える。この危機に対して細胞は、酸化損傷mRNAを細胞内から排除する生体防御機構を有していると考えられる。そこで我々は、その様な分子機構の解明を目指して研究を行ってきた。
これまでの我々の研究から、酸化RNAに相互作用する因子としてAUF1タンパク質を同定している。AUF1はmRNA上のAU-richな配列を好み結合するRNA結合因子として知られていたが、我々の解析から新たに酸化されたRNA上の酸化損傷塩基８－オキソグアニン（8-oxoG）を認識して強く結合する事が明らかになった。また、酸化ストレスを受けた細胞内でのAUF1の機能を明らかにするために、ゲノム編集技術を用いてヒト培養細胞HeLa S3株からAUF1ノックアウト細胞を樹立した。樹立したAUF1ノックアウト株を用い酸化ストレス下でのmRNA分解を測定したところ、HeLa S3株に比べて、その分解が抑制されている事が明らかになった。この結果から、酸化損傷mRNAの排除機構としてAUF1が分解を通して働いている事が示された。
そこで我々はAUF1と共に酸化損傷mRNAの分解に機能している因子の分離、同定を目的として本研究を開始した。そのための工夫として、新たな酸化RNAプローブとして8-oxoGを人工的に組み込んだオリゴヌクレオチドを合成し用いた。このプローブを用いて実験を行った結果、8-oxoGを含むRNAに対する結合因子として新たに複数のタンパク質を同定した。これらの因子にはAUF1と同様に多くのRNA結合因子が含まれており、酸化mRNA排除機構において何らかの役割を果たす事が予想される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究において、我々は生化学的なアプローチを用いて解析を進めてきた。具体的には試験官内で酸化させて調製した酸化RNAをプローブとしたin extract結合実験系による、酸化RNA結合因子の分離・同定である。その結果、酸化RNAと相互作用する因子としてAUF1タンパク質を同定しており、この方法論は今後実験を進めていく上でも有効であると考えている。ただし、これまでに用いてきた酸化RNAプローブは試験官内での酸化処理時に8-oxoG以外の損傷塩基が生じている事が予想されるため、結合物中に目的以外の相互作用因子が含まれる可能性がある。
そこで、今年度は新たに、8-oxoGを含むオリゴRNAを人工的に合成し相互作用因子分離のためのプローブとして用いた。この新規プローブを用いて、AUF1と共に酸化RNA、特に８－オキソグアニン（8-oxoG）を含むRNA鎖と相互作用する因子の分離を行ったところ、複数の候補タンパク質を分子する事ができた。
これらの相互作用因子をマス解析により同定した。その結果、それらの候補因子には、これまでにRNA結因子として報告されているタンパク質が複数含まれていた。それらRNA結合タンパク質について、8-oxoGを含むオリゴRNAとの結合性を調べたところ、特異的な結合性を示す事が再確認された。
現在は、in vitro系での結合実験のために精製タンパク質調製の準備を始めている。また、これら候補因子の機能解析を行うためのゲノム編集技術を用いたノックアウト株樹立の準備にも着手している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本申請研究におけるこれまでの結果から、新規8-oxoG RNA結合因子を複数分離している。これらの候補因子にはRNA結合タンパク質が含まれており、それらの中に8-oxoG RNAを特異的に認識して結合し、何らかの機能を果たしている因子が存在していると考えている。
そこで、新たに得た候補因子について8-oxoG RNAとの結合性を確認するためにin vitroでの結合実験をおこなう。そのために大腸菌を用いた組換えタンパク質発現系を確立し、精製タンパク質を調製する。調製した精製タンパク質を用いて結合実験を行う事で、候補因子と8-oxoG RNAとの結合が直接的であるかを調べる。
また、結合性が確認された因子については、8-oxoG RNA結合因子として機能解析を行う。そのために、CRISPR/Cas9 systemを用いたゲノム編集技術によってヒト培養細胞株よりノックアウト株を樹立する。樹立後は、その細胞を用いて酸化ストレス応答への各因子の影響を調べる。特に、酸化ストレス下でのmRNA安定性、異常タンパク質の合成及び細胞死（アポトーシス）誘導などについて解析を進めていきたい。
最終的には、酸化ストレスが細胞機能を失わせる機構を明らかにし、細胞変性疾患や老化、ガンなどの疾病を予防する方法の開発に路を開きたい。
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| Causes of Carryover |
研究が順調に進行し、8-oxoG RNA相互作用因子の分離・同定がスムーズに行われたために当初予定していた予算を少し下回る結果となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今後の研究進展において分子生物学的、生化学的実験において用いる試薬の購入にあてる。
また、8-oxoG RNA結合因子のノックアウト株樹立において培地、シャーレなどを大量に消費する事が予想されすため、その購入にあてる。
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