2016 Fiscal Year Research-status Report
ナノ構造体内部への選択的タンパク質取り込み機構の解明
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16K07264
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
野口 恵一 東京農工大学, 学術研究支援総合センター, 准教授 (00251588)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ナノ粒子 / ナノ構造体 / タンパク質シェル構造体 / ウィルス様粒子 / 結晶構造 / X線回折 / 透過電子顕微鏡 / 認識配列 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エンカプスリンは、分子量 30-40 kDa の単一のタンパク質が自己集合することにより形成される直径 25-55 nmの中空の球状ナノ構造体である。特定の酵素を内包することにより、効率的な反応場や細胞にとって毒性のある基質や生産物を隔離する場を提供する細胞内微小区画であると考えられており、構造体のサイズ、安定性、内包するタンパク質の種類を制御することが可能となれば、マイクロリアクターやマイクロセンサー等としての活用が期待される。本研究では、内包するタンパク質の認識に関わる相互作用を特定することによりタンパク質の取り込み機構を明らかにし、ナノ構造体への外来タンパク質の効率的な内包手法の基盤を確立することを目的として研究を進めている。
これまでに、エンカプスリン内部へのタンパク質の内包に関わる37アミノ酸残基からなる認識配列を推定し、この配列全体を外来タンパク質のC末端に付加することによりエンカプスリンへ外来タンパクが内包可能なことを明らかにした。平成28年度は、エンカプスリンへの内包に必須となる認識配列中の部位を特定するために、外来タンパク質に付加する認識配列の一部を削除し内包実験を行った。エンカプスリンとの内包の可否や効率の検討には、これまでに確立した緑色蛍光タンパク質やルシフェラーゼとの共発現系を用いた。その結果、認識配列のC末端側から15残基程度を削除すると外来タンパク質がエンカプスリンにほとんど内包されなくなった。他方、認識配列のN末端側を削除した場合、これまでのところ、内包に大きな影響を与えないという結果を得ている。したがって、認識配列の中でもC末端側に内包に必須となる部位が存在すると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度の研究により、エンカプスリンへの内包に関わる認識配列と推定したアミノ酸配列の中でC末端側の15残基の中に内包に必須な領域が存在することが示唆される結果を得た。この領域のアミノ酸残基がエンカプスリン内壁の特定の領域と相互作用することにより内包が制御されていると予想されることから、引き続きアミノ酸残基の特定を進めるとともに、結晶構造解析、タンパク質間生物物理学的相互作用解析、質量分析等の手法で実験を進めることにより、内包機構の解明につながることが期待できる。
また、認識配列のN末端側を削除した場合について、予備的な結果ではあるが、内包効率に影響を与える可能性が示す結果を得ていることから、ナノ構造体への外来タンパク質の効率的な内包手法の基盤に結びつく結果も得られつつある。
以上より，研究全体として，概ね計画通りに進行していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、内包に必須と予想されたペプチド（10～15残基程度を想定）を化学合成し、エンカプスリンとの複合体の結晶構造解析を行い、エンカプスリン内壁のシグナル配列認識部位を特定する。これまでに、エンカプスリンの分解能3.3オングストロームのＸ線回折データ収集に成功していることから、平成29年度後半には複合体の結晶化から予備的なデータ収集までは達成できると予想している。シグナルペプチドとの分子間相互作用を評価するために十分な回折データが得られない場合は、結晶化条件の改良や結晶の脱水処理などを行い、分解能の改善を試みる予定である。また、複合体の構造解析は、現在結晶解析を進めているエンカプスリン単独での結晶構造をプローブとした分子置換法で初期構造を得て、構造精密化を行う予定である。
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