2016 Fiscal Year Research-status Report
プリオンの異常化を抑制する四重鎖核酸の分子設計と抑制メカニズムの解明
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16K07269
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
真嶋 司 京都大学, エネルギー理工学研究所, 助教 (20707426)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | NMR / アプタマー / 四重鎖核酸 / プリオン病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
プリオンタンパク質の正常型から異常型への構造遷移と、それによって生じた異常型プリオンタンパク質の蓄積がプリオン病の原因と考えられている。申請者等は正常型プリオンタンパク質に強く結合するr(GGAGGAGGAGGA)配列のRNA分子、R12がプリオンタンパク質の構造遷移を抑制できること、すなわち抗プリオン活性を有することを見出した。さらにR12が抗プリオン活性を発揮するメカニズムを明らかにするために、R12とプリオンタンパク質の結合部分ペプチドとの複合体構造をNMR法によって決定した。本研究では、R12の立体構造の情報およびプリオンタンパク質との相互作用の情報を活用し、より抗プリオン活性の高いRNA分子の創製と、抗プリオン活性を発揮するメカニズムの解明を目指した。本研究が達成されることで、抗プリオン薬剤の創薬のための基盤の確立と、また近年注目さている核酸医薬の発展へと寄与することが期待される。
平成28年度は、R12の立体構造に基づいて設計したRNA分子、R24の構造解析のための配列の最適化と、最適化の結果得られたR24類似体の構造解析を試みた。R24は高い抗プリオン活性を有するが、立体構造に多型性があるため、抗プリオン活性を発揮するメカニズムを構造科学的に解明するのは困難であった。そこでR24の多型性を解消するために末端残基の付加や適切な部位への残基の挿入などによって配列の最適化を施した。得られたR24類似体は良好なNMRスペクトルを示し、スペクトルの解析から単一のコンフォメーションで存在することが示唆された。このR24類似体の立体構造と、プリオンタンパク質との相互作用様式の解明を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度の研究計画書の予定通り、単一のコンフォメーションで存在し、立体構造と抗プリオン活性のメカニズムの解明に適したR24類似体の探索を行った。その結果、R24の適切な部位にリンカー残基を挿入することで、良好なNMRスペクトルを示すR24類似体を見出した。このR24類似体のNMRスペクトルは、その配列から予想されるNMRシグナル数と一致するため、単一のコンフォメーションとして存在することが期待された。そこでR24類似体について各種二次元NMRスペクトルを測定したところ、現在解析途中ではあるが、四重鎖構造のトポロジーが一系であることが概ね確定できた。また7割近くのプロトンの共鳴線の帰属を達成した。以上より、当該年度中に目標として設定した予定の計画は概ね達成できたとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度に引き続き、R24類似体のNMRスペクトルの解析を進行する。共鳴線の帰属の完了後、NOEに基づく距離情報およびプロトン-プロトン間のカップリング定数に基づく糖のパッカリング情報などを抽出し、立体構造の計算を行う。また今回得られたR24類似体の抗プリオン活性を、ヒトのプリオン病を感染させたマウスの生細胞を用いて評価する。さらにR24類似体と正常型プリオンタンパク質との相互作用について、ゲルシフト法等の生化学的実験と、CD 及びNMR を用いた分光学的実験によって調べて、分子レベルおよび残基レベルの相互作用の情報を得ることを目指す。この相互作用実験では、塩濃度、緩衝液のpH及び温度等を系統的に変えて試験し、R24 類似体と正常型プリオンタンパク質の複合体の形成に最適な実験条件を決定する。得られた最適な実験条件のもとで、R24類似体とプリオンタンパク質との複合体の立体構造の解析を試みる。
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| Causes of Carryover |
単一のコンフォメーションで存在するR24類似体の探索に時間がかかったため、その抗プリオン活性を評価する実験が限られた回数しか行えなかった。そのため、大量のRNAを合成する必要がなくなり、物品費が低く抑えられた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
構造解析に適したR24類似体を発見できたので、その配列のRNAを大量に合成することに使用する。合成したR24類似体について、抗プリオン活性を評価する実験を行う。またプリオンタンパク質との相互作用実験ならびに複合体の構造解析を行ううえで、13C及び15N安定同位体標識を施すための13C標識グルコース及び15N標識塩化アンモニウムの購入に使用する。またRNA分子の構造解析に必要となる、13C, 15N安定同位体標識された核酸合成用アミダイトの購入を計画している。
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