2016 Fiscal Year Research-status Report
アポトーシスにおけるミトコンドリア分裂と共役したクリステ構造変化の分子機構
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16K07274
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
大寺 秀典 九州大学, 医学研究院, 助教 (40380612)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / クリステ / アポトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA損傷や抗癌剤の刺激に応じて、ミトコンドリアは分裂し、クリステ内に貯留されるチトクロムCを放出してアポトーシスが開始します。DRP1が細胞質から分裂面へ移行してミトコンドリアは分裂します。哺乳動物細胞には３種のDRP1外膜レセプター（Mff、MiD49、MiD51）が知られていますが、分裂反応のメカニズムと細胞機能における役割分担は不明でした。
最近、申請者はアポトーシス誘導時、Mffとは異なり、MiD49/51がDRP1と協調してクリステ再編を引き起こし、チトクロムC放出に働く確証を得ました。本研究ではこの研究をさらに進め、アポトーシスにおけるミトコンドリア形態変化の生理的意義とその分子基盤の解明を目指します。
アポトーシスにおけるミトコンドリア構造の変化を解析するためアポトーシスに耐性を示す細胞株を作成した。アポトーシス刺激によるミトコンドリア形態変化を野生型細胞とこの耐性細胞とで比較する事により誘導されるミトコンドリア構造変化がアポトーシスによるものであると確定される。この目的のためBcl-2ファミリーに属しアポトーシスの抑制的に働くBaxとBakの二重欠損細胞をゲノム編集により作成した。
アポトーシス誘導するとミトコンドリアの分裂を伴うクリステ構造変化により膜間部よりシトクロムCが放出される。この際に生じるミトコンドリアの分裂はDrp1膜受容体であるMiD51により制御される。そこでMiD51のミトコンドリア膜場での詳細な局在部位を調べるためMiD51-GFP融合タンパク質を発現する細胞を作成して、GFP抗体による免疫電顕解析を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Drp1により実行されるミトコンドリアの分裂にはMiD51によるものとMffにより制御される２種が存在する。このうちMiD51により制御される分裂のみがアポトーシスにおけるクリステ構造変化に関与していること我々は既に報告している。アポトーシスの際に細胞質に放出されるシトクロムCはクリステ内部に貯留されている。クリステは外膜とクリステジャンクションと呼ばれる構造によって繋がっている。クリステ構造変化における役割から、MiD51がクリステジャンクションに選択的に局在している可能性が考えられるが免疫電顕解析によりこの考えの答えを得ることができた。
アポトーシス誘導時に引き起こされるミトコンドリア構造変化を解析するためにはその比較対象となる細胞株が必要である。すなわち確かにアポトーシス刺激により引き起こされる構造変化であるかである。これまでにBax/Bak二重欠損細胞を作成して確かに本細胞ではアポトーシス刺激により誘導されるミトコンドリア形態変化が生じないことを確認することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
MiD51はN末アンカー型であり膜間スペース（IMS）領域、膜貫通ドメイン（TMD）、DRP1リクルートに働く細胞質領域に分けられます。分裂サイト形成場所の決定におけるIMS/TMD領域の役割を調べるため、他のN末アンカーのIMS/TMD領域と置換したキメラタンパク質を作製します。MiD51 KO細胞に発現させ、分裂サイト形成、CJへの局在化、ミトコンドリア分裂能を調べます。さらに、MiD51の細胞質領域をMffのもの（DRP1リクルート能を持つ）と置換したキメラタンパク質をMiD51 KO細胞に入れ戻して、チトクロムC放出欠損が回復するかを調べます。
MiD51の膜間スペース領域（２８アミノ酸）は内膜のOPA1などのCJ構成因子あるいはMICOS構成因子と相互作用する可能性があります。分裂サイトはダイナミックに形成•解離を繰り返しているため、還元操作によりリンカー部位が切断可能なDSPを用いて生細胞クロスリンクした後、免疫沈降を実施してCJ構成因子やMICOS構成因子との結合を調べます。
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| Causes of Carryover |
試薬等の性能向上により必要とする試薬の節約が可能となったため。
また予定していた出張を諸事情により控えたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度は計画している実験の多くを受託解析費用に回すことにより効率的な研究推進を目指す。
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[Journal Article] Mitochondrial division occurs concurrently with autophagosome formation but independently of Drp1 during mitophagy.2016
Author(s)
Yamashita SI, Jin X, Furukawa K, Hamasaki M, Nezu A, Otera H, Saigusa T, Yoshimori T, Sakai Y, Mihara K, Kanki T.
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Journal Title
J Cell Biol.
Volume: 215
Pages: 649-665
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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