2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K07276
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
池水 信二 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 准教授 (60333522)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 構造生物学 / 蛋白質 / 分子認識 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトはウイルスなどの侵入に対してナイーブヘルパーT（Th0）細胞はTh1細胞に分化して、マクロファージや細胞障害性細胞を活性化してウイルスや細胞内抗原の除去を行う。インターロイキン(IL)-27は、Th0細胞からTh1細胞の分化誘導の初期に関わる分子でる。IL-27はfour helix bundle構造をもつp28と２つのfibronectin type ⅢドメインをもつEpstein-Barr virus induced gene 3 (EBI-3)からなる。IL-27の受容体は、特異的なWSX-1とIL-6などと共有されるgp130からなる。本研究の目的は、IL-27/WSX-1/gp130複合体の結晶構造を解明し、Th1細胞分化機構を構造生物学的に解明することである。
p28とEBI3はジフルフィド結合を介さない二量体を形成しており、精製中に不安定であったため、リンカーでつないだ一本鎖(s)IL-27のコンストラクトを作成して、動物細胞を用いて発現させた後、精製を行った。WSX-1は大腸菌を用いて発現させた後、精製を行った。精製したsIL-27とWSX-1を混ぜた後、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより複合体として精製を行った。sIL-27/WSX-1複合体の結晶化条件の検索を行ったが、結晶の形成は確認出来ていない。gp130のドメイン(D)1からD3までを昆虫細胞を用いて発現させた後、精製sIL-27/WSX-1複合体と混合して、sIL-27/WSX-1/gp130複合体として精製を試みたが、gp130(D1-D3)はsIL-27/WSX-1複合体と結合しなかった。現在、gp130とWSX-1のドメインを増やして三者複合体の調製を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
IL-27は、p28とEBI3を共発現させた後精製を行ったが、試料が不安定であった。そのため、リンカーで繋いだ一本鎖試料として発現させた後、精製を行なった。sIL-27は収量は低かったが、動物細胞により発現させた後、精製することに成功した。
WSX-1は大腸菌で発現させた後、精製することに成功している。精製したWSX-1はsIL-27と複合体として精製することに成功しており、sIL-27/WSX-1複合体として結晶化条件の検索を進めているところである。
gp130については、昆虫細胞を用いてD１からD３までの領域の発現系を構築して、精製することに成功した。しかしながら、精製したgp130 (D1-D3)はsIL-27/WSX-1複合体への結合が確認できなかった。そこで、WSX-1 (D1-D3)のコンストラクトと、gp130 (D1-D4)のコンストラクトの作成を行い、発現系の構築を行い、発現・精製を行った。現在、これらのタンパク質について、複合体形成が可能であるか確認を進めているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
WSX-1については、単体試料の精製に成功しており、結晶化条件の検索を進めてきたが、未だ結晶の確認に至っていない。今後、更に結晶化条件の検索を進め、単独WSX-1の結晶化・構造解析を進める予定である。
sIL-27/WSX-1複合体については、調製方の確率に成功しており結晶化を進めているが、未だ結晶化に成功していない。今後、さらなる条件検索を行い、結晶化・構造解析を進める。構造解析することにより、sIL-27とWSX-1の認識機構を原子レベルで詳細に解明する。また、sIL-27の発現量が低いので、発現系の改良も行い、より収量の高い調製方の確立を目指す。
sIL-27/WSX-1/gp130複合体の調製については、現在のコンストラクトであるgp130 (D1-D3)ではsIL-27/WSX-1 (D1-D2)複合体に結合しなかったので、gp130 (D1-D4)およびWSX-1 (D1-D3)の発現系の調製を行った。これらの試料を用いてsIL-27/WSX-1/gp130複合体の調製を行う。sIL-27/WSX-1/gp130複合体を精製した後、結晶化条件の検索を進め、構造解析を行う。得られた三者複合体の構造を基に、IL-27と２つの受容体WSX-1とgp130の結合様式およびシグナル伝達機構を解明して、Th1細胞分化機構を構造生物学的に解明する。
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| Causes of Carryover |
（理由）
研究費は概ね計画通りに執行したが、端数が生じたため96,677円繰り越した。
（使用計画）
最終年度である平成30年度の試薬・消耗品費などの物品費に繰り越した予算を使用する予定である。
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