ヒトRNAポリメラーゼIIと基本転写因子TFIIHのNMR法による複合体構造解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07277
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 奥田 昌彦 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 特任准教授 (60448686)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: タンパク複合体 / NMR / 基本転写因子 / RNAポリメラーゼII

Outline of Annual Research Achievements

基本転写因子TFIIHは10個の異なるタンパク（サブユニット）からなる高分子量複合体である。転写のみならずDNA修復や細胞周期にも働く多機能タンパクである。TFIIHのサブユニットの1つ、p62タンパクは、アミノ末端にプレクストリン相同（PH）ドメインをもち、タンパク－タンパク間相互作用を通じて、TFIIH複合体を必要な場所へとリクルートする。我々はこれまでにPHドメインとその結合パートナーとして知られる、基本転写因子TFIIEα、腫瘍抑制因子p53、DNA修復因子XPCとの複合体の立体構造を核磁気共鳴（NMR）法により決定してきた。これらの複合体構造解析から、結合パートナータンパクは共通した構造原理に基づいてPHドメインを認識、結合していることが明らかとなった。そこで、この構造原理を利用し新たな結合パートナーを探索したところ、RNAポリメラーゼIIのサブユニット（ここではPol II-subと表記する。）が見出された。実際に、Pol II-subはPHドメインと特異的に結合するを実験で確認した。本研究では、両者の複合体の立体構造をNMR法で決定し認識機構を明らかにすることを目的とした。
本年度は、既に確立している大腸菌発現系からp62 PHドメインの非標識試料、および13C、15N標識試料を調製した。また、結合領域だけを含むPol II-subを化学合成ペプチドとして調製した。加えて、結合領域を含むアミノ末端領域、および全長領域を調製するために、それぞれの大腸菌発現系を確立し非標識試料を調製した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

p62 PHドメインに関してはNMR測定に十分な量の非標識試料、および標識試料を調製することができた。Pol II-subについては計画通り結合領域を化学合成ペプチドとして調製した。結合に関与する領域のみに限定した理由は、NMR法では感度が対象試料の分子量に大きく依存し、高分子量になるほど感度が低下するからである。しかしながら、領域を限定せずありのままのタンパク全長を解析することが望ましい。幸いなことにPol II-subは全長としてもNMR法で解析可能な範疇にある。但し、p62 PHドメインとの複合体として構造解析可能かは不明であるため、これを確かめるために大腸菌発現系を確立し試料を調製した。以上の理由から当初の計画からはやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

複合体構造解析を開始するにあたり、Pol II-subにおいて結合領域のみを対象にするべきか、結合領域を含むアミノ末端領域、あるいは全領域にするかを早期に決める。決定後、Pol II-subの13C、15N標識試料を調製する。各試料から13C、15N標識Pol II-sub－非標識p62 PH複合体、および13C、15N標識p62 PH－非標識Pol II-sub複合体を調製し、種々のNMR測定を行う。スペクトルを解析し構造情報を得る。収集した情報を距離および角度制限情報として立体構造計算を行う。最初に複合体における各タンパクの構造を解き、次に分子間NOEシグナルを解析し複合体の最終構造を決定する。

Causes of Carryover

当初予定外の実験を実施したことにより研究がやや遅れ計画していた構造解析や構造計算等に使用する予定のPC等の購入を見合わせた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

今年度購入予定のPC等を次年度に購入し、効率的な研究推進に役立てる。