2016 Fiscal Year Research-status Report
シトクロムP450還元酵素からシトクロムP450への電子移動機構解明
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16K07280
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
杉島 正一 久留米大学, 医学部, 准教授 (30379292)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 秀明 久留米大学, 医学部, 准教授 (60271996)
坂本 寛 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 教授 (70309748)
福山 恵一 大阪大学, 工学研究科, 招へい研究員 (80032283)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 酵素 / 分子間相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シトクロムP450(P450)はステロイドの生合成等の脂質代謝や薬物代謝において重要な役割を果たす酵素である。P450が酵素反応に必要な酸素分子を活性化するためには、鉄硫黄クラスターを補因子とするアドレノドキシン(Adx)やフラビン酵素であるシトクロムP450還元酵素(CPR)からの還元力が必要である。この電子移動経路の詳細を明らかにするためには、酸化還元複合体の立体構造が必要である。Adx-P450複合体については、バクテリアホモログにおいて、すでに構造解析例があるが、CPR-P450複合体に関しては、いまだに構造解析例がない。そこで、本研究では、シトクロムP450還元酵素とシトクロムP450との複合体について、結晶構造を得ることやそれらを用いた二酵素間の電子移動反応の機能解析を目的とした。
その目的を達成する第一段階として、本年度はopen 型安定化CPR（ΔTGEE）と強く相互作用するP450 の探索を行った。FLAGタグを付加したΔTGEEと抗FLAGタグ抗体を使用した免疫沈降法により、ΔTGEEと相互作用すると思われるタンパク質分子を、ラット肝マイクロソーム画分から共精製した。その成分について、質量分析法による同定を行った結果、ΔTGEEと相互作用すると思われるP450が二種類同定された。
今年度得られた結果をもとに、次年度以降の研究では相互作用すると思われるP450二種類の発現・精製系の確立を行い、精製ΔTGEEとの相互作用測定を行うことができる。以上のように次年度以降の研究進展へとつながる結果を本年度は得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度の研究計画の目標は、ΔTGEEと強い相互作用を示すシトクロムP450を同定することであった。実際に抗FLAGタグ抗体を使用した免疫沈降と質量分析法により、ΔTGEEと相互作用を示すシトクロムP450の候補二種類が同定できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
免疫沈降と質量分析の結果、同定されたシトクロムP450の候補二種類について、発現・精製系を構築し、実際にΔTGEEと強い相互作用を示すかどうかを精製シトクロムP450を用いて検討する。強い相互作用を示す場合は、そのシトクロムP450とΔTGEEとの共結晶を得るために、結晶化スクリーニングを進める。
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| Causes of Carryover |
ほぼ計画通りに使用したため、次年度使用額は少額であった。その差は試薬等の見積り額と実際の支払額の若干のずれによって生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の研究に必要な試薬・消耗品の購入に使用する
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Research Products
(28 results)
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[Journal Article] A substrate-bound structure of cyanobacterial biliverdin reductase identifies stacked substrates as critical for activity2017
Author(s)
Haruna Takao, Kei Hirabayashi, Yuki Nishigaya, Haruna Kouriki, Tetsuko Nakaniwa, Yoshinori Hagiwara, Jiro Harada, Hideaki Sato, Toshimasa Yamazaki, Yoichi Sakakibara, Masahito Suiko, Yujiro Asada, Yasuhiro Takahashi, Ken Yamamoto, Keiichi Fukuyama, Masakazu Sugishima, Kei Wada
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Journal Title
Nature Communications
Volume: －
Pages: 14397
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] A microfluidic-based protein crystallization method in 10 micrometer-sized crystallization space2016
Author(s)
Masatoshi Maeki, Shohei Yamazaki, Ashtamurthy S. Pawate, Akihiko Ishida, Hirofumi Tani, Kenichi Yamashita, Masakazu Sugishima, Keiichi Watanabe, Manabu Tokeshi, Paul J. A. Kenis, Masaya Miyazaki
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Journal Title
CrystEngComm
Volume: 18
Pages: 7722-7727
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Phosphonate-based irreversible inhibitors of human γ-glutamyl transpeptidase (GGT). GGsTop is a non-toxic and highly selective inhibitor with critical electrostatic interaction with an active-site residue Lys562 for enhanced inhibitory activity2016
Author(s)
Akane Kamiyama, Mado Nakajima, Liyou Han, Kei Wada, Masaharu Mizutani, Yukio Tabuchi, Akiko Kojima-Yuasa, Isao Matsui-Yuasa, Hideyuki Suzuki, Keiichi Fukuyama, Bunta Watanabe, Jun Hiratake
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Journal Title
Bioorganic and Medical Chemistry
Volume: 24
Pages: 5340-5352
DOI
Peer Reviewed
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