2016 Fiscal Year Research-status Report
グレリン受容体を活性化するアルパカ由来ナノボディの作製と結晶構造解析への応用
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16K07281
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
児島 将康 久留米大学, 付置研究所, 教授 (20202062)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | グレリン / グレリン受容体 / ナノボディ / アルパカ / パンニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
グレリン受容体を無細胞系で発現させ、リポソームに組み込み、これを抗原としてアルパカに免疫した。このアルパカからリンパ球を採取し、mRNAを分離した。ナノボディをコードするIgG、すなわち重鎖一本鎖抗体のIgG2とIgG3をPCRで増幅し、抗原認識部位のcDNAを得た。これを発現ベクターに組み込み、ファージに発現させ、ファージディスプレイ・ライブラリを構築した。
グレリン受容体タンパク質を無細胞系で合成しビオチン化リポソームに組み込んだものを、ストレプトアビジンでコートされた96well マイクロプレートに固定した。固定は室温で2時間行い、そのあと1%BSAのブロッキング液を満たして、非特異的な吸着を抑えるようにした。109~1010/mlのファージ液を200 μl 各well に加え、室温で1時間置いた。リポソームを使っているために洗浄液（PBS）には界面活性剤を含めなかった。PBSで5回ウォッシュし、0.1M グリシン・バッファーでグレリン受容体リポソームに結合したファージを溶出した。コントロールとしてグレリン受容体ではなくアデノシンA2A受容体を用いて同様なパンニング操作を行い、非特異的な吸着を調べた。この結果、上記の条件ではグレリン受容体とコントロールのリポソームの間で、結合したファージ数に差がなく、パンニング操作がうまくいかなかった。
そこでファージ液をコントロール・リポソーム (A2A) に5回連続で結合させて非特異的なファージを出来るだけ除き、そのあとにグレリン受容体リポソームに結合させることにした。さらにブロッキング液として1％BSAとともに1%スキムミルクも検討した。溶出においてもグリシン・バッファーではなく、トリプシン液を使って結合したファージをマイルドな条件で溶出するようにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
グレリン受容体に対するナノボディ作製において、1年目にファージディスプレイ・ライブラリを完成し、バイオ・パンニングによるスクリーニングにまで進んだ。本年はパンニングの条件設定に取り組んで、非特異的な結合を低下させるための、実験条件やブロック用の試薬、溶出条件などを検討し、現時点での最適なパンニング条件を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初計画のグレリン受容体を活性化するナノボディを取得するために重要な点は、パンニング操作の改良である。
パンニング操作では当初、非特異的な結合が多く、グレリン受容体リポソームとコントロールとの差ができなかった。様々な改良の後に、ようやく両者の差があるパンニング操作を見出したが、それでもその差はわずかである。今後は同様なパンニング操作を3～4回と繰り返し、グレリン受容体に対するナノボディを濃縮していく。
また現在ではパンニング操作に使うリポソームは、免疫につかったものと同じものなので、リポソーム自体に対するナノボディの作製も考えられる。そのために非特異的な結合が多いと想像される。そこでこれを回避するために、パンニングに使うグレリン受容体タンパク質を、現在の無細胞でのリポソームに組み込む合成方法ではなく、昆虫細胞で合成したグレリン受容体を直接スクリーニングプレートに結合させて、これをターゲットにパンニングすることを試みる。
このような改良点から、出来るだけ多くのグレリン受容体認識ナノボディを得て、そのなかから受容体のリガンド結合部位を認識するものを選び出す予定である。
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| Causes of Carryover |
グレリン受容体に対するナノボディのスクリーニングにおいて、アルパカへのグレリン受容体タンパク質の免疫、採血、リンパ球の精製、cDNAの増幅、ファージディスプレイ・ライブラリの構築とまでは順調に進んだが、パンニングの条件検討に手間取り、予定の消耗品購入の必要性が停止したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
バイオ・パンニングの条件が整ったため、予定通りの進行で研究を進めるため、使用計画は当初のままで行う。
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Research Products
(7 results)
