2016 Fiscal Year Research-status Report
Eh V-ATPaseのNa+選択ポンプ機構の構造基盤の解明
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16K07282
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
村田 和義 生理学研究所, 脳機能計測・支援センター, 准教授 (20311201)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 膜タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では腸内連鎖球菌Enterococcus hirae（Eh）由来のATP駆動型ナトリウムポンプであるV-ATPase（Eh V-ATPase）の全複合体の構造を電子顕微鏡単粒子解析により明らかにし、その選択性イオン輸送の分子機構を解明する。
１）位相差クライオ電子顕微鏡法による構造解析：
申請者はこれまでに電顕用ゼルニケ位相板を用いることにより、界面活性剤で可溶化したEh V-ATPaseの氷包埋試料の可視化に成功している。本研究ではこの手法を用いて３万粒子を超えるクライオ電顕画像を撮影して、単粒子解析を行った結果、分解能2nmを超える構造マップを得ることができた。
２）構造の固定化：
V-ATPaseはATPの結合と加水分解によりおもに３つの構造状態を取ることがが知られている。クライオ電顕単粒子解析では、このことがマップの高分解能化の障害になると考えられる。そこで、我々は、V-ATPaseのATP駆動回転子であるdサブユニットにPAタグを挿入した改変分子を作製し分子の再構成を行い、これに抗体を反応させることで構造を固定したEh V-ATPase複合体を作製した。そして、同様にこのクライオ電顕単粒子解析を行った。その結果、分解能2 nmの構造マップを得ることができ、抗体の結合している様子も確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Eh V-ATPaseの位相差クライオ電子顕微鏡による単粒子構造解析では、2 nmを超える分解能で立体構造を得ることができた。ATP加水分解活性をもつ可溶性部分のV1領域、これを支える２本のストークの構造を確認できた。さらに，膜内のV0領域では、膜を貫通するcリングの構造に加えて、イオンの選択性イオンポンプとして重要な働きをするaサブユニットの2本の長い膜貫通ヘリックスとこれと直交するヘリックスの構造を確認できた。さらに、抗体で固定した複合体では、抗体が回転子であるdサブユニットの目的の部分に結合している様子を確認できた。これらはプロジェクトの進行の上で大きな進歩である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、さらにマップの高分解能化のために画像枚数を増やすとともに、試料の改良、画像の取得とこれを選択する手法を検討する。
１）電顕用膜穴グリッドの改良：試料をのせる膜穴グリッドに金をわずかに蒸着することにより、チャージアップを軽減し（Russo et al., 2014）、像質の向上を図る。高分解能位相差画像として最適な金の蒸着厚を検討する。
２）界面活性剤の検討：現在、Eh V-ATPaseは0.05% DDMで可溶化しているが、これが粒子画像のコントラストを下げる原因になっている。現在、高分解能構造解析に用いられているLMNGやAmphipolなどの界面活性剤がEh V-ATPaseに使用できないかを検討する。
３）現在、画像は電子直接検出カメラを用いてサブミリ秒のフレームに分割して記録し、これを選択・ドリフト補正・ドーズ補正して画像を再構成している。これらの選択ならびに補正方法が最適になるように再検討することで画像の高分解能化を図る。
そして、得られた高分解能電顕マップに部分的に解析されているX線結晶構造をフィッティングし、イオン選択制イオンポンプの分子機構を明らかにする。
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