2017 Fiscal Year Research-status Report
枯草菌一般ストレス応答蛋白質の構造とシグナル分子の解明
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16K07287
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| Research Institution | Japan Synchrotron Radiation Research Institute |
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Principal Investigator |
熊坂 崇 公益財団法人高輝度光科学研究センター, タンパク質結晶解析推進室, 主席研究員 (30291066)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | X線結晶解析 / 微生物 / ストレス応答 / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は以下のような研究を実施した。
1. RsbQ未知シグナル分子の同定: 枯草菌RsbQの未知シグナル分子の同定について、昨年度に実施した細胞抽出物とRsbQの複合体の結晶構造を踏まえ、抽出物の同定を進めた。種々の有機溶媒で処理した細胞画分の抽出物とRsbQの複合体を大量調製し、質量分析を試みたが、残念ながら現時点で優位なシグナルは得られていない。
2. RsbPの全長構造解析に向けた結晶化: PASおよびホスファターゼドメインの部分構造はすでに決定しているが、全長構造が得られていないため、その解析に向けた結晶化を進めた。種々の結晶化スクリーニングキットを用いて0.5 uLの微量分注により効率的な条件検討を行ったが、結晶は得られていない。
3. RsbP金属配位子のX線蛍光分析: 既知のドメイン結晶構造では活性中心のMnイオンが観測できていない。そこで、透析によるMnの添加や除去を試み、その試料についてXAFS測定を行った。その結果、大腸菌発現時のMn供給は不十分で、精製時に緩衝液にMnを添加することではじめて、蛍光が観測できた。結合したMnは３度の透析では除去できないため、これを今後の実験に用いることとした。
4: RsbP溶液散乱構造の解析:上記の結果を受けて、Mnの有無およびリガンドの有無について、試料調製条件の再検討を行い、SEC－SAXS法により、高精度の溶液散乱データを取得した。現在、解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度の実施体制の変更を受けて実験計画を見直し、Rsbタンパク質群以外のタンパク質、特にObg, RplK, RplM, RelAについて計画していた発現系の全面的な見直しによる効率化を一旦見送り、RsbPおよびRsbQの研究に集中して実施することとした。RsbP/Qに関しては一部を除き、順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
RsbP全長については新たな試料調製法を確立できたため、活性測定と結晶化、シグナル分子複合体の溶液散乱データの解析を進める。RsbQ結晶で結合が観測された未同定の分子については、引き続き質量分析を利用して構造解明を目指す。RsbSについては、既存データの解析を分子モデリングを進めながら改めて行うとともに、他の研究予算で実施している新規結晶化技術開発とも連携を行い、開発が進めば非対称単位中に少ない分子数が含まれるような結晶の調整を狙う。
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| Causes of Carryover |
論文発表の準備中であったが、実験の予定に若干の遅れが生じたため、その費用を繰り越すこととなった。
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