2016 Fiscal Year Research-status Report
脂質非対称センシング機構の解明および応用研究の基盤形成
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16K07288
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
小原 圭介 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (30419858)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 脂質 / 脂質非対称 / 細胞膜 / センシング / 真菌感染症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞膜の脂質二重層間では脂質組成や役割が異なるが、本研究ではその様な脂質非対称の状態をセンサータンパク質Rim21が感知する分子機構の解明と応用研究に向けた基盤形成を目指している。
平成28年度は、Rim21のC末端細胞質領域（Rim21C）に存在するセンサーモチーフが、実際に膜のどの様な状態を感知することで脂質非対称をモニターしているか、という問題に対してin vivoとin vitro解析によって新たな知見を得る計画であった。In vivo解析に関しては、細胞膜脂質に関する様々な突然変異体を用いてGFP-Rim21Cと細胞膜との結合を顕微鏡下でモニターした。その結果、細胞膜内層に豊富に存在するホスファチジルセリンがRim21Cと細胞膜の結合に関与することを示唆した。一方、in vitro解析では、Rim21Cの組換えタンパク質の大量精製が難航している。しかし、これまでに試した大腸菌での発現系、カイコ幼虫での発現系に加えて、小麦胚芽抽出物を用いた無細胞系での大量精製も試みたところ、純度はかなり改善された。収量は依然として十分ではないため、さらなる改善が必要である。その一方で、Rim21Cと様々な脂質組成の人工膜との相互作用を、より少ない量のRim21Cでも解析出来る方法も模索しており、リポソームとGST-Rim21Cを用いたバイオレイヤー干渉法で良い感触を得た。
病原性真菌類のRim21は真菌感染症に対する良い創薬ターゲットとなる可能性がある。そこで、病原性真菌Candida glabrataのRim21C領域をクローニングし、GFP融合タンパク質として出芽酵母に発現したところ、出芽酵母のRim21Cと同様の挙動を示した。すなわち、出芽酵母と病原性真菌類では同様の感知システムが機能していると予想され、出芽酵母で得た知見を適用できる可能性が高くなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
脂質非対称センサーが実際にモニターする細胞膜の状態について、負電荷を有するホスファチジルセリンがセンサーモチーフとの相互作用に関わることを示唆したのは大きな前進である。これまでに、センサーモチーフはホスファチジルセリンを含めた幾つかの負に荷電した脂質と結合することをin vitro lipid overlay assayで示してきたが、ホスファチジルセリン合成酵素の欠損株を用いたin vivo解析でそれを支持した形となった。ホスファチジルセリンは細胞膜では細胞質側の層にほとんどが存在し、非対称分布を示す脂質分子種の代表例となっており、存在量も多い。したがって、細胞内でもセンサーモチーフと相互作用しうるトポロジーであり、実際のセンシング過程を捉えている可能性が十分にある。これらのことから大きな前進と言える。
一方で、in vitro解析は、Rim21C組換えタンパク質の大量精製が難航していることから期待した様な成果は得られていない。その中でも、試行錯誤によって無細胞発現系でこれまで以上に純度の高い組換えタンパク質が精製できたこと、また少量の組換えタンパク質でも人工膜との相互作用を定量的に解析出来る実験系の構築に目途がたったこと、などは明るい材料である。
病原性真菌類のRim21Cが、出芽酵母と同様の挙動を示す事を示唆し、出芽酵母で得た知見を適用しうることを示した点は評価できる。
総合すると、おおむね順調に伸展していると判断出来る。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も、今年度に得られた成果をもとに脂質非対称センシング機構の解明と応用に向けた礎の構築を目指す。
これまで通り、細胞膜脂質に関する変異体を用いたGFP-Rim21Cの動態追跡によって、実際にin vivoでセンサーモチーフが識別する脂質分子種や膜環境を調査する。一方で、難航しているin vitro解析については、Rim21C組換えタンパク質の大量精製を可能とする様な発現系の構築を引き続き行う。その一方で、人工膜との相互作用を少量のRim21Cでも定量解析できる実験系の模索も引き続き行う。具体的には、バイオレイヤー干渉法によって定量解析を行える可能性が出て来たため、バイオレイヤー干渉法を第一選択肢として実験系のブラッシュアップを行う。Rim21C組換えタンパク質の大量精製が可能となった場合は、人工膜の存在下と非存在下でRim21Cの状態を比較する。脂質との相互作用に伴ってRim21Cには、変性領域に二次構造の出現あるいはその逆が起こると予想している。こういった構造変化をCDスペクトル測定などで検出することを試みる。構造変化が検出できた場合は、NMR解析に供し、脂質非対称センシング機構の原子レベルでの解明を目指す。
病原性真菌類のRim21に関し、出芽酵母のRim21の解析から得られた知見を活用して、変異解析などを行い、病原性真菌類のRim21の分子解剖を行う。また、病原性真菌類のRim21の機能を損なわせる化合物をスクリーニングし、真菌感染症の予防・治療に寄与する知見を得ると共に、創薬の足掛かりにする。
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| Causes of Carryover |
平成28年度の研究が概ね順調に進行したため、繰り返し行う必要がある条件検討などが予定よりも少なく済んだ。したがって、消耗品の費用が予定よりも少額で済んだため、次年度使用額が生じた。また、研究成果を学会で発表するための旅費も、早期の航空券の予約などで予定より低額で済んだのも理由の一つである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度に、予定通りに進行しなかった部分（in vitro解析）に力を入れて研究を行う予定であるが、この部分は特殊や試薬やキットなど高額な消耗品を多数必要とする。主にその消耗品費に充てる。
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Research Products
(4 results)
