2016 Fiscal Year Research-status Report
認知症治療薬の開発を目指した膜内切断プロテアーゼ調節機構の解析
| Project/Area Number |
16K07290
|
|---|
| Research Institution | Tohoku University |
|---|
Principal Investigator |
二井 勇人 東北大学, 農学研究科, 准教授 (90447459)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 膜内切断プロテアーゼ / 認知症 / 酵母 / 酵素 / 脳・神経 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
膜内でタンパク質を限定分解する膜内切断プロテアーゼは膜貫通領域に活性中心を持つため、精製と活性の評価が難しく、酵素機能・機構が明らかではない。本研究では、認知症の原因となるアミロイドβ（Aβ）ペプチドを産生するγセクレターゼ複合体と、そのモデルとなる単量体膜内切断プロテアーゼ（ロンボイド等）について、活性調節や基質認識に必要な領域を同定し、詳細な酵素学的性状から基質導入機構を解明することを目的とした。研究代表者は、膜内切断プロテアーゼのうち、ヒトγセクレターゼ複合体を酵母において再構成することに成功し、試験管内でγセクレターゼ活性を測定できる系を世界で初めて開発している。この系を用いてヒトγセクレターゼの詳細な酵素学的性状・複合体内のサブユニット構成が活性に及ぼす影響、リン脂質による活性の変化など、酵素としての基本的な性質を明らかにしている。酵母内に再構成したγセクレターゼの切断活性は、酵母の生育を指標に評価することも可能であるため、スクリーニング系としても有用である。平成２８年度には、γセクレターゼの触媒サブユニットプレセニリン(PS1)と、調節サブユニットAph1から、プロテアーゼ活性を上昇させる活性化変異を発見した。酵母膜画分を用いた酵素学的解析と哺乳類細胞（PS1・PS2破壊胚性線維芽細胞）を使った解析から、活性化変異により、Aβのトリミングが進み、認知症の発症に関わる長鎖Aβが減少することを明らかにした。この成果は現在投稿準備中である。γセクレターゼ複合体をターゲットとした認知症の治療戦略において重要な知見であり、毒性の高い長鎖Aβ42の生成を減少させるγセクレターゼのモジュレーターの開発に道を開くものである。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
実施を予定していた１）γセクレターゼの変異と活性調節タンパクの同定２）ロンボイドとSite-2プロテアーゼの活性評価系の構築について、それぞれについて、達成度を自己評価する。
１）酵母γセクレターゼ発現系を用いた解析から、γセクレターゼの活性化変異体を発見し、薬剤の開発においても重要な、変異が集中するホットスポットの情報が得られた。そして、酵母膜画分を用いた酵素学的解析から、PS1活性化変異体では認知症の発症に関わる長鎖Aβが減少することを明らかにした。PS1変異についての解析が当初の計画以上に進展したため、29年度以降に計画していた哺乳類細胞を用いたγセクレターゼ活性調節機構の解析を行い、以上の成果をまとめて、現在投稿論文を準備中である。活性調節タンパクのスクリーニングでは、陽性の同定には至っていないが、次年度以降に継続して行う。
２）ロンボイドとSite-2プロテアーゼの活性評価系では、転写因子Gal4を接続した人工基質をロンボイド・Site-2プロテアーゼと一緒に酵母に導入し、 Galレポーターの発現をもとに、生育やβガラクトシダーゼ活性で活性の評価を試みた。当初の計画は達成したが、人工基質の切断が、導入した膜内切断プロテアーゼだけではなく、酵母の内在性のプロテーアーゼが大きく依存していることを示す結果を得ていて、今後、最適化する必要がある。
|
| Strategy for Future Research Activity |
これまでに得られた成果をさらに発展させ、以下の解析を行う。
１）これまでに、プレセニリンPS1とAph1から、γセクレターゼを活性化する変異を同定した。これらの変異体の活性を哺乳類細胞においても確認するため、マウス胚繊維芽（MEF）細胞（プレセニリン１・プレセニリン２遺伝子ノックアウト細胞）もしくはヒト胚腎臓細胞（HEK293）に導入して、変異が基質切断におよぼす影響を明らかにする。PS1変異体の一部については、28年度に既に実施済みであり、それ以外の変異体の解析を進める。
２）プレセニリンPS1について、立体構造情報をもとに基質が導入される経路として予想される各膜貫通領域に変異を導入し、活性を評価する。変異のデザインにおいては、酵母のスクリーニングから見つかっている活性化変異の位置情報を有効活用する。特に、第９膜貫通領域の可動性、第一膜貫通領域の可動性を変化させる各種変異の検討を行う。
３）ロンボイドとSite-2プロテアーゼの活性評価系は、酵母の内在性のプロテーアーゼによるバックグラウンドでの切断が大きく、アッセイ系としては、未完成な状況である。酵母内の遺伝子操作（プロテアーゼ遺伝子の破壊）等により、活性評価系を最適化する。
|
| Causes of Carryover |
実験計画は概ね計画通り進んだが、酵母を用いたスクリーニング実験の一部で陽性クローンを得られず、予定していた幾つかの支出について行わず、次年度使用額が生じた。この実験については、平成２９年度以降に行う。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成２９年度において、酵母を用いたスクリーニング実験に使用する。
|
