2016 Fiscal Year Research-status Report
人工細胞システムによる細胞情報クロストークの実現と細胞動態解析
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16K07293
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
湊元 幹太 三重大学, 工学研究科, 准教授 (80362359)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
瀧口 金吾 名古屋大学, 理学研究科, 講師 (20262842)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 人工細胞 / 細胞情報 / プロテオリポソーム / 膜タンパク質 / 細胞骨格 / リポソーム / GUV / 人工膜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究全体の課題「GPCRから環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネル(CNG)開放へ至る経路と、インテグリン(ITG)と細胞骨格関連タンパク質からなる経路を、再構成する」を実施するために、本年度は、主に、研究代表者の改良するリポソーム作製方法と、開発に携わってきた組換えバキュロウイルス／リポソーム膜融合によるプロテオリポソーム作製法とを、基盤技術として本課題の遂行に使用できるようにさらに調整することを目標の中心に据えた。平成28年度の具体的な実施目標は、第一は、アドレナリン受容体(ADRB)、CRF受容体(CRHR)の促進性GPCR、Gタンパク質、アデニル酸シクラーゼ(ADCY)を発現して再構成する場合にcAMPの産生を捉えうる環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルCNG(4量体)の人工細胞膜への再構成である。外部Mg2+,Ca2+の流入の程度をイオンプローブで顕微評価することを試みた。このとき、人工脂質膜ベシクルには巨大リポソーム（Giant Unilamellar Vesicle、GUV）を利用し、その作製法には、界面通過法（droplet transfer method）を採用した。この方法は内容物の封入を容易にするが、静置水和法と作製したGUVを用いた場合とリン脂質膜とバキュロウイルスの膜融合後の性状に違いがあることが、本研究の基礎実験で分かり、より良い評価法を考案するためのデータも得られたので、年度後半に論文投稿した。
ITGと細胞骨格関連タンパク質の再構成についても、人工脂質膜ベシクル（リポソーム）と組換え膜タンパク質発現バキュロウイルス出芽粒子との混合を利用した、膜融合法や脱水再水和法により、比較的温和な液性条件での作製条件を探っているところであり、進捗結果のスナップショットを学会発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今回、CNGの再構成ならびに環状ヌクレオチドを感受し開放するゲート活性をGUV上で検出する試みに取り組むにあたって、バキュロウイルスによる発現方法とウイルス粒子に調製方法、GUVの作製方法、条件設定、画像情報の取得と処理、データ解釈などに関する、これまで総合的に行ってきた研究の中に位置づけながら、実施してきた。GUVを用いる利点は、個々のGUVについて、顕微鏡観察によって情報を取得できることである。一方で、本質的に取得できるデータに、比較的小さくないばらつきが伴う。本年度は、界面通過法で作製したGUVとモデルとして選んだ野生型ウイルス、ならびにRFP融合GPCR(CRHR1)発現ウイルスとの融合を検討し、本方法で作製したGUV膜へのウイルスの融合挙動が、脂質標識では均一拡散するが、膜タンパク質標識ではパッチ状が顕著となることを明らかにした。微妙な性状比較を簡便に行えるよう、多数のGUV個々に個別番号を振り、それぞれについてサイズや詳細な蛍光輝度情報を得ることによって、同一条件のGUVでのばらつき具合を把握し、膜融合を制御するpHの各値での変動を統計的に解釈することで、GUVのサンプルであってもより明瞭にウイルスとの膜融合挙動を捉えられることを実証し、研究分担者とともに論文投稿している。このスタンスでの評価が確立したことで、本課題への今後の取り組み方が明瞭となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
H28年度の実施状況を踏まえつつ、CNG導入リポソーム、ITG導入リポソーム、を具体的に評価できるよう、ひきつづき、GUVプロテオリポソーム作出方法のさらなる改良に取り組んでいく。評価のための方法としては、H28年度の成果から、ある程度のGUV集団情報のばらつき具合の変動を、統計的な裏付けをもって追跡することを、基本としたい。その評価方法については、さらに検討、改良が必要であるから、それにも取り組む。そして、上記ターゲット膜タンパク質の相互作用の上流、下流に置くことが可能なタンパク質についても、組換え体の共発現などを検討する。とくに、本課題をさらに進めるべく、H29年度は、ADCYとCNGと共導入、あるいは、ITGとの相互作用がおこる、細胞骨格関連タンパク質の発現導入とITGやアクチンとの共導入、などを実験の目標として設定する。研究分担者、連携研究者と、密に議論を行いながら、進め予定である。
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| Causes of Carryover |
今年度は、概ね順調に進んでいるものの、新規備品の導入などによる条件検討等を含む実験により若干の計画的使用が遅れたことや、並行して行っているプロジェクトの実験により関連性の高い費用（プラスチック類、必須培地類、などの物品費、ならびに、当該研究分野に関連する学会参加費などの経費）が一部節約されたことなどによって、当初の予定の額と比べて著しく使用額に違いが生じたとは考えないものの、次年度使用額が生じた。特に、実験消耗品に関する物品費については、上記理由のほか、複数業者の利用を図りながら、見積比較やキャンペーンの積極的な利用を行うなど、つねにコストを可能な限り抑えようと努めたこと、も理由になると考えられる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初の請求額と併せて研究遂行のために、この次年度使用額は、次年度の配分額に合わせて、研究の進捗を見極めながら、適切に、有効に、支出するようにする。また、論文投稿料や英文校閲料、論文別刷料などに関して、現地外国通貨による立替払等の場合には、円相場の実質支払額への影響のため、その変動が極めて大きいし、また、昨今のように円安傾向にある場合には、実験等で多く利用している試薬やキット類などの輸入製品類の価格も、今後高騰していくであろうと思われる。今回のような繰り越し分は、そのための費用変動を吸収することにもなり、適切に使用することができる。合わせて、今後もコスト削減等による効率的かつ効果的な研究費の支出にも努力する。
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