2018 Fiscal Year Research-status Report
人工細胞システムによる細胞情報クロストークの実現と細胞動態解析
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16K07293
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
湊元 幹太 三重大学, 工学研究科, 准教授 (80362359)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
瀧口 金吾 名古屋大学, 理学研究科, 講師 (20262842)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 人工細胞 / 細胞情報 / プロテオリポソーム / 膜タンパク質 / 細胞骨格 / 脂質二分子膜 / GUV / マイクロコンパートメント |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目標は、受容体の情報が伝達され応答として現れる系を構築することである。インテグリン(ITG)、細胞骨格関連タンパク質からなる経路、または、環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネル(CNG)などを、人工膜へ再構成することをめざしている。H30年度は、前年度までの実施状況を踏まえつつ、ひきつづき、CNG導入・ITG導入リポソーム等を評価できるよう、GUVプロテオリポソームの改良に取り組むとともに、それに類する人工細胞モデルの構築も検討してきた。
H30年度の実施内容は、つぎの通りである。前年度までに本研究でバキュロウイルスを用いた組換え膜タンパク質導入の方法が適用できることを示した界面通過法（droplet transfer method）により作製したGUVを用いて、イオン透過の経過観察を行いチャネル機能評価のための準備をした。また、同じく前年度報告した逆相遠心法によって多数（大量）のGUVを効率的に調製したのち、バキュロウイルス出芽ウイルス粒子との膜融合試験に供し、GUVプロテオリポソーム作製に利用可能であることを示した。
また、前年度に引き続き、自由な膜からなるベシクルにこだわらない人工膜に対して組換え膜タンパク質をバキュロウイルス出芽粒子との混合により導入する方法の検討を進め、GPCR等の組込みに成功した。細胞モデルとなるミクロコンパートメントとして最近注目されている、異なる水性高分子溶液に現れるミクロ液滴を用いて、その内部に細胞骨格タンパク質（ここではアクチン）や核酸などを封じ込める実験も並行して行った。そして、細胞情報伝達系のモデル構築のために有用な知見を得た。
以上について、プログレススナップショットとして学会で発表を行い、また一部は論文化している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）界面通過法により作製したGUVに対する、バキュロウイルス（エンベロープ型DNAウイルス）の出芽ウイルス粒子（BV）の膜融合を用いてCNGチャネル評価のためのイオン透過性試験法の検討を前年度に引き続いて進めてきた。その基準となる、脂質膜のカルシウムイオンのイオン透過の経時変化を、イオノフォアを用いて単一GUVレベルの観察で追跡することが出来た。今後H29年度に上記方法で得たGUV膜へ組換え膜タンパク質の導入を行っているので、CNGを導入した人工膜を作りその活性の評価を試みて行く。
２）H29年度に、GUVの大量調製の方法を、逆相法をベースに再検討し逆相遠心法として改良し論文公開した。本方法で得たGUVへの組換えタンパク質導入を行うため、BVとの融合実験を行い、比較的効率よく多数のGUVがBVと融合する条件を、脂質組成、融合誘起のためのpH等の試験から、見出してきている。高頻度で目的受容体等を組込んだプロテオGUVが得られる条件は本課題の遂行に役立てられる。
３）昨年度までに（～H29年度）膜脆弱性を回避するため、自由膜で無い、球状人工細胞膜の作製条件を追試験し、BVに発現提示したインテグリンなどの膜タンパク質を上記に埋め込む条件を得てきている。今年度は、特に情報伝達に重要なGタンパク質共役受容体をモデルにその作製条件、および、人工脂質膜への提示を特異的な抗体結合でアッセイできる条件について、ともに検討を進め、これら条件を見定めつつある。
４）GUVと同様に細胞サイズのモデルミクロコンパートメントとして注目を集めつつある水性二相分離系の水／水ミクロ液滴内へ、細胞骨格タンパク質であるアクチンを捕捉し、その局在性を検討し、細胞情報伝達系のモデル構築のために有用な知見を得た。
１）～４）の進捗から、概ね順調に計画は運んでいると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述の本課題に関連する研究成果について論文・学会発表等を次年度に予定している。そのため、本研究課題の期間の延長を既に申し出て、認められている。また、本課題に関するテーマをさらに発展させた新規課題が採択されており、引き続きそちらを推し進めていく。
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| Causes of Carryover |
本研究課題の当初の研究期間内において既に成果を数報の論文として刊行しているところである。最終年度の現時点において、本研究課題に関する研究成果を、さらに1点程度、論文としてまとめるべく原稿を執筆しており、それが次年度の投稿となるためその費用を次年度使用額と見込んだ。
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