2016 Fiscal Year Research-status Report

DNA複製異常が引き起こすヒストン転写抑制システムの分子解明

Research Project

Project/Area Number	16K07302
Research Institution	Teikyo University
Principal Investigator	高山優子帝京大学, 理工学部, 講師 (90461467)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords	ヒストン / 分裂酵母 / ＤＮＡ複製
Outline of Annual Research Achievements	ヒストン遺伝子はS期に転写活性化されるが、DNA複製が停止したときには転写が速やかに抑制されることが知られている。そのため、ヒストン転写とDNA複製進行をモニターしている機構があると考えられているが、これまでその分子機構は明らかになっていない。申請者は分裂酵母を研究材料にして、DNA複製停止チェックポイント因子とヒストン転写活性化因子が相互作用する予備的結果を得ていた。そこで、本年度はタンパク質間の相互作用の確認および、来年度に向けた予備実験を開始した。１．相互作用の解析全長Ams2とCds1部分断片を用いたYeast Two Hybridにより、ポジティブな結果が得られた。さらに、Ams2の部分断片を用いた解析により、Cds1部分断片との相互作用の部位が弱いながらも２か所あることがわかった。さらに、Ams2とCds1が細胞内で相互作用していることを、共免疫沈降法による確認を行った。Ams2はS期限定に発現することから、ヒドロキシ尿素によるS期同調細胞から細胞抽出液を作成し、免疫沈降を行った。しかし、Cds1の免疫沈降産物量が少なく、共免疫沈降の確認ができなかった。現在、プラスミドによる強制発現条件下および架橋剤処理による条件下での実験を行っている。２．細胞周期を通したヒストン転写量の変動解析 Ams2とCds1の相互作用によりヒストン転写が制御されているならば、Cds1遺伝子欠失株ではヒストン転写量の変動に変化がみられる可能性がある。そこで、細胞周期を同調するためにcdc25-22変異をCds1遺伝子欠失株に導入した。現在、細胞同調の確認を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason １．Yeast Two Hybrid法による相互作用の解析　全長Ams2とCds1部分断片でポジティブな結果が得られた。さらに、Ams2の部分断片を用いた解析により、Cds1部分断片との相互作用の部位が弱いながらも２か所あることがわかった。一方、Cds1全長とのYeast Two Hybrid解析は、結果が得られていない。当初使用していたCds1には点変異が存在していたことから、変異がないCds1を再度クローニングして解析を行ったが、Ams2との相互作用は確認することができなかった。そのため、Cds1部分断片の結果を参考に、免疫沈降実験を行った。２．共免疫沈降法による相互作用の確認　Ams2とCds1が細胞内で相互作用していることを、共免疫沈降法による確認を行った。Ams2はS期限定に発現することから、ヒドロキシ尿素によるS期同調細胞から細胞抽出液を作成して、免疫沈降を行った。しかし、Cds1の免疫沈降産物量が少なく、共免疫沈降の確認ができなかった。現在、プラスミドによる強制発現条件下および架橋剤処理による条件下での実験を行っている。３．細胞周期を通したヒストン転写量の変動解析　Ams2とCds1の相互作用によりヒストン転写が制御されているならば、Cds1遺伝子欠失株ではヒストン転写量の変動に変化がみられる可能性がある。そこで、細胞周期を同調するためにcdc25-22変異をCds1遺伝子欠失株に導入した。現在、細胞同調の確認を行っている。
Strategy for Future Research Activity	平成２８年度に行った、Ams2とCds1の共免疫沈降実験による相互作用の確認を進める。具体的には、Ams2とCds1をプラスミドにより高発現させて、共免疫沈降解析を行う。並行して、ホルマリンによるたんぱく質間の架橋により、共免疫沈降の効率を高める方法でも確認を行う。また、Cds1とAms2の相互作用破綻によるヒストン転写抑制の影響の解析を行う。平成２８年度に作成したCds1遺伝子欠失cdc25-22温度感受性変異株を用いて、G2期に細胞同調後、細胞周期を進行させて各時間の細胞をサンプリングし、RT-PCRによってヒストン転写量の変化を測定する。また、cdc25-22温度感受性変異株にCds1をプラスミドで導入し、過剰発現したときの細胞周期を通してのヒストン転写量を測定する。 Ams2は過剰発現させると、細胞周期非依存的にヒストン転写量が増加する。この時、Ams2の分解抑制型である時には、細胞増殖が阻害されることが知られている。そこで、Cds1遺伝子欠失株にAms2を過剰発現させたときの、細胞増殖への影響やクロマチン形成の変化等について検討する。これらの結果を基に、ヒストン転写におけるCds1の役割を考察する。次年度以降の実験のために、複製チェックポイントに関与するMrc1やChk1のプラスミド作成し、チアミン制御による発現系を構築する。さらに、Mrc1やChk1遺伝子欠失におけるヒストン転写量を測定するために、cdc25-22変異との二重変異株を作製する。
Causes of Carryover	平成２８年度１０月に超低温フリーザーの購入を予定していたが、設置予定部屋に改装計画が持ち上がったため、改装後に非常電源を導入した後に購入・設置することにした。そのため、フリーザー購入予定額（65万円）を次年度に使用することになった。また、消耗品で計上していたReal-Time PCR試薬やディスポーザブル用品についてはキャンペーン時にまとめて購入したので予定額を下回った。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度の研究費使用計画は、細胞同調実験のための培地・フラスコや発現誘導物質、Real Time PCR検出試薬やcDNA合成キットを購入予定である。フリーザーは設置環境が整い次第、購入する。また、本研究の進捗状況を発表し、幅広い分野の方々からご助言をいただくことが本研究推進にとって必須であるため、学会参加に伴う旅費の使用を予定している。