2017 Fiscal Year Research-status Report
DNA複製異常が引き起こすヒストン転写抑制システムの分子解明
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16K07302
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
高山 優子 帝京大学, 理工学部, 講師 (90461467)
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2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ヒストン / 分裂酵母 / ＤＮＡ複製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒストン遺伝子はS期に転写活性化されるが、DNA複製が停止したときには転写が速やかに抑制されることが知られている。そのため、ヒストン転写とDNA複製進行をモニターしている機構があると考えられているが、これまでその分子機構は明らかになっていない。申請者は分裂酵母を研究材料にして、DNA複製停止チェックポイント因子とヒストン転写活性化因子が相互作用する予備的結果を得ていた。本年度は、昨年度に引き続きヒストン転写因子Ams2とDNA複製停止チェックポイントCds1との相互作用を免疫沈降で確認し、Cds1とヒストン転写量の関係について実験を行った。さらに、最近Ams2と関連する新規因子がDNA複製と関連するとの報告があったことから、この新規因子を含めてDNA複製とヒストン転写関連の実験を行った。
１．細胞周期を通したヒストン転写量の変動解析
Ams2とCds1の相互作用によりヒストン転写が制御されているならば、Cds1遺伝子欠失株ではヒストン転写量の変動に変化がみられる可能性がある。そこで、薬剤による細胞同調を行うことで、ヒストン転写量の経時変化をRT-PCRにより確認したが、うまく細胞同調できなかった。そこで、温度感受性変異による細胞同調実験に変更した。
２．Ams2とCds1の相互作用の確認
Ams2とCds1が細胞内で相互作用していることを、共免疫沈降法による確認を行った。本年度は、架橋剤やBuffer条件検討後、免疫沈降実験を行った。現在、共免疫沈降の再現性を確認している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
１．細胞周期を通したヒストン転写量の変動解析
Ams2とCds1の相互作用によりヒストン転写が制御されているならば、Cds1遺伝子欠失株ではヒストン転写量の変動に変化がみられる可能性がある。そこで、HUによる細胞同調を行うことで、ヒストン転写量の経時変化をRT-PCRにより確認することにした。しかし、コントロールの野生株は細胞周期同調できたが、Cds1遺伝子欠損株では細胞同調することができなかった。そのため、cdc25温度感受性変異株での細胞同調に切り替えたため、当初の予定から遅れている。
２．Ams2とCds1の相互作用の確認
Ams2とCds1が細胞内で相互作用していることを、共免疫沈降法による確認を行った。本年度は、架橋剤処理による条件下で実験を行った。架橋剤や細胞破砕時のbuffer検討を繰り返し、免疫沈降の条件決めで時間がかかってしまった。現在、実験の再現性を確認している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２９年度に行った、Ams2とCds1の共免疫沈降実験による相互作用の再現性を確認して、論文用データまでにブラッシュアップする。また、Cds1とAms2の相互作用破綻によるヒストン転写抑制の影響の解析を行う。これまでに同調条件を確認できたので、Cds1遺伝子欠失cdc25-22温度感受性変異株を用いて、G2期に細胞同調後、細胞周期を進行させて各時間の細胞をサンプリングし、RT-PCRによってヒストン転写量の変化を測定する。また、HU処理の有無によるAms2のヒストンプロモーター結合の変化を確認する。その結合変化にCds1の相互結合が関係しているかについて検討していく。
さらに最近、Ams2関連新規因子がDNA複製と関連することが報告された。そのため、この新規因子も共に解析していく予定である。
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| Causes of Carryover |
平成29年度にこれまで使用していた細胞計数機器の調子が悪く、うまく細胞濃度を調節することができなかった。そこで、新規機器の購入をするために定価の金額で前倒し請求を行った。購入時には相見積による検討の結果、定価より安く購入できたため差額が生じた。次年度の研究費使用計画は、細胞同調実験のための培地・発現誘導物質、Real Time PCR検出試薬やPCR用のプライマー合成を購入予定である。また、本研究の進捗状況を発表し、幅広い分野の方々からご助言をいただくことが本研究推進にとって必須であるため、学会参加に伴う旅費の使用を予定している。
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