2019 Fiscal Year Research-status Report
DNA複製異常が引き起こすヒストン転写抑制システムの分子解明
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16K07302
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
高山 優子 帝京大学, 理工学部, 准教授 (90461467)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヒストン / DNA複製 / 転写制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒストン遺伝子はS期に転写活性化されるが、DNA複製が停止したときには転写が速やかに抑制されることが知られている。しかし、これまでその分子機構は明らかになっていない。申請者は分裂酵母を研究材料にして、DNA複製停止チェックポイント因子とヒストン転写活性化因子が相互作用する予備的結果を得ていた。本年度は、細胞周期同調とDNA複製阻害剤の組み合わせによりDNA複製停止チェックポイントCds1遺伝子とヒストン転写因子Ams2のプロモーター結合およびヒストン転写量の関係について実験を行った。さらに、最近DNA複製進行速度とゲノム不安定性に関しての報告があったことから、DNA複製遅延とヒストン転写関連の実験を行った。
１．細胞周期を通したAms2プロモーター結合とヒストン転写量の変動解析
昨年度、細胞周期を通してAms2や転写ターゲットであるヒストン遺伝子の発現量の変化をWestern blotやRT-PCRにより確認したところ、Cds1遺伝子破壊株中ではAms2の核局在が変化することを見いだした。そこで本年度は、Ams2 の核局在変化がS期進行阻害による可能性について検討するために、DNA複製阻害剤であるHU処理を同時に行った。Cds1遺伝子破壊株では、ヒストンRNA量がHU添加により減少することがわかった。
２．DNA複製に関連したゲノム不安定性の検定
DNA複製速度の遅延がゲノム不安定性を引き起こされることが報告された。そこで、DNA複製遅延によるゲノム不安定性について検討するために、ゲノム不安定性を定量化できる検出系を確立した。Ams2遺伝子単独破壊やヒストン遺伝子破壊株ではゲノム不安定化は野生株と大きく変わらなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
１．細胞周期を通したヒストン転写量の変動解析
Ams2とCds1の相互作用によりヒストン転写が制御されているならば、Cds1遺伝子欠失株ではヒストン転写量の変動に変化がみられる可能性がある。昨年度、細胞周期を通してAms2や転写ターゲットであるヒストン遺伝子の発現量の変化をWestern blotやRT-PCRにより確認したところ、Cds1遺伝子破壊株中ではAms2の核局在が変化することを見いだした。そこで本年度は、cdc25温度感受性変異株による細胞周期同調とDNA複製阻害剤であるヒドロキシ尿素処理を組み合わせて実験を行った。この細胞周期同調と薬剤添加の条件をそろえることが困難であり予定より大幅に時間がかかってしまった。DNA複製阻害剤添加時では、Cds1遺伝子破壊株において、ヒストン転写量が減少することがわかった。これらの結果から、ヒストン転写量の維持にCds1が関与していることが示唆された。
２．DNA複製に関連したゲノム不安定性の検定
DNA複製速度の遅延がゲノム不安定性を引き起こすことが報告された。Ams2破壊株において、ゲノムが不安定であることが知られている。DNA複製遅延によるヒストン転写とゲノム不安定性の関連について検討するために、ゲノム不安定性の頻度を定量化できる検出系を確立した。ゲノム変化を頻発させることが知られている遺伝子破壊株を試し、本解析系が有効であることを確認した。この系を用いてゲノム不安定化を定量したところ、Ams2遺伝子単独破壊やヒストン遺伝子破壊株では野生株と変わらない結果となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
詳細な細胞周期同調とDNA複製阻害剤との併用により、Cds1遺伝子欠損株中ではヒストン転写量が減少していることを明らかにした。この結果は、ヒストン転写量の維持にCds1が関与していることを強く示唆している。そのため次年度は、このヒストン転写量の減少が、転写制御によるものかRNAの安定性の変化によるものかどうかを明らかにしたいと考えている。そこで、（1）ヒストン転写因子のプロモーター結合量の変化をクロマチン免疫沈降解析により確認する。（2）RNA構成阻害剤を用いたRNA安定性実験を行うことを予定している。これらの結果から、どちらの制御にCds1が直接または間接的に関与しているかを見極めていく。
また、Cds1とAms2やヒストン遺伝子との二重遺伝子破壊株を作成してゲノム不安定化の頻度を測定する。これにより、DNA複製停止時に起こるヒストン転写量とゲノム不安定性の関連を数値化し、S期に関わるゲノム維持について考察することで論文投稿準備を進めていく。
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| Causes of Carryover |
消耗品で計上していたディスポーザブル用品をキャンペーンでまとめて購入したことにより、予定価格よりも安価となった。また、細胞周期同調の条件決めに多くの時間をとられ、高額な消耗品であるReal-time PCR関連品の使用が少なかったことが原因である。次年度には、これらの消耗品を主に購入し、さらにゲノム不安定性解析用の培地やシャーレを購入する予定である。
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