バクテリアトキシンによるリボソーム依存mRNA切断反応メカニズムの解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07310
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 竹本 千重 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサ イエンス技術基盤研究センター, 副チームリーダー (40306527)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: バクテリアトキシン / リボヌクレアーゼ / リボソーム / 構造解析 / 触媒機構 / mRNA

Outline of Annual Research Achievements

バクテリアトキシンRelEは、リホソーム中でmRNAを切断するエンドリボヌクレアーゼであり、アミノ酸飢餓に応答してタンパク質合成を阻害する役割を果たしている。その反応機構は、切断後のRNA断片の末端が2',3'-cyclic体であることから、切断反応に金属が関与しない一般酸塩基触媒機構が提案されている。しかし、既知構造から予測される重要残基の変異による活性損失が顕著でない等、未解明な点が残されている。本研究では、申請者らが決定した野生型RelEとリボソーム・mRNA複合体構造に基づいて、有効な変異体を設計し、反応メカニズムの詳細を明らかにしたいと考えている。
平成29年度は、構造の詳細比較から触媒機構への関与が新たに見出されたグルタミン酸(E45)の変異体を作成し、活性への関与を検討した。触媒残基として重要性が論じられているK57, Y88と距離が近いので、電荷や疎水性を考慮して、４種類の変異体(E45A, E45D, E45L, E45N)をpET11bベクターにクローニングし、BL21株及びKRX株を形質転換した。しかし、いずれもコロニーを得ることはできず、RelEの活性は野生型と変わらないことが示唆された。一方、RNA切断反応を解析するために、非変性条件下でのRelEの調製を検討した。これまで野生型RelEはアンチトキシンであるRelBと共発現させた後、厳しい変性条件に晒して乖離させ、続いて透析による巻き戻しを行っていた。生体内では、プロテアーゼによるRelBの切断が乖離を促すとされている。そこで、大腸菌BL21株の無細胞タンパク質合成系による発現を試すことにした。反応温度条件の検討、活性残機が集中しているC末へのタグの付加、大腸菌のアンチトキシンであるRelBの共存など、様々な手法を試したが、ほとんど何も合成できなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

結晶構造(pre-state)で、切断部位のmRNAのでオキシ体をリボヌクレオチドに置換して、エネルギー最小化計算を行い、得られた構造について、局所的pKaの計算を行い、反応前後の構造比較など行ったところ、RelEによる切断反応機構は、一般さん延期触媒機構で説明されるRNase AタイプよりもRNase T1タイプである可能性が高いことが示唆された。そこで、mRNA切断反応メカニズムを解明する手法として、最近進展が著しいクライオ電子顕微鏡による解析を試みることにした。現在、高度好熱菌の70SリボソームとP-siteを占めるtRNAとmRNAの複合体を調製して、4オングストローム程度のデータを得ている。引き続き, 野生型RelEを加えた複合体のデータ収集を行っている。これによって、まずは得られている結晶構造の正しさを証明し、さらにmRNAとRelEを含む部分だけを解析することで反応メカニズム解明への手がかりが得られると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

(1) 変性条件を使って精製した野生型RelEと通常条件で精製した変異体について、無細胞タンパク質合成系での標準タンパク質合成の阻害活性を測定し、overallな活性の比較を行う。
(2) 結晶構造解析の結果を軸とした論文を発表する。
(3) クライオ電子顕微鏡による解析を進めて、反応メカニズムを解明する。

Causes of Carryover

計算機もしくはストレージの購入を勘案していたが、年度末になり機種選定に手間取って発注できなかった。計算機関係は、トレンドが変わるので、性能と価格の関係を見極めて、次年度の早い段階で必要なスペックを決めて購入する予定である。