2017 Fiscal Year Research-status Report
DNA結合蛋白質の機能解析のためのマイクロ秒時分割単分子計測技術の創出
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16K07313
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
鎌形 清人 東北大学, 多元物質科学研究所, 助教 (90432492)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | １分子計測(SMD) / 蛋白質 / 遺伝子 / 分子認識 / 生体分子 / がん |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA結合タンパク質は、膨大なDNAの中から標的配列を探し出し、結合する。DNA結合タンパク質の標的配列の探索には、実験的に検証しにくい“ホッピング”や“セグメント間移動”などの探索機構が存在する可能性がある。本研究では、従来の装置の分解能ミリ秒以内に起こる“ホッピング”などの探索機構を検証し、DNA結合タンパク質が標的配列を認識し結合する過程を明らかにする。
まず、がん抑制DNA結合タンパク質p53のマイクロ秒の分解能での計測を行い、“ホッピング”を検証した。サブミリ秒の時間分解能の単分子蛍光装置を用いて、蛍光色素修飾したp53が、DNAガーデン法によりガラス基板に固定されたDNA上を動く様子を撮影した。DNA上でのp53の時系列データには、DNAと接触した状態で移動する“スライディング”に加えて、短い距離の“ホッピング”が含まれているこが明らかとなった。従来の方法では“ホッピング”が時間平均により“スライディング”の中に埋もれ、検出することが難しいが、マイクロ秒の分解能での計測により“ホッピング”を“スライディング”から分離して検出することに成功した。
次に、障害物のあるDNAにおいてp53がDNA探索時に障害物を回避する仕組みとして、あるDNAから別のDNAへ移動する“セグメント間移動”が考えられる。そこで、“セグメント間移動”を検証するため、DNAガーデン法を改良し、ガラス基板上に2本のDNAを十字に固定する方法を開発し、蛍光色素修飾p53がDNA間を移動するかを検証した。その結果、p53は、プラスの電荷をもった天然変性領域を用いて、DNA間を高速で移動することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
まず、マイクロ秒の分解能でのp53の計測を行い、“ホッピング”を検証した。単分子蛍光装置を用いて、蛍光色素修飾したp53が、DNAガーデン法によりガラス基板に固定されたDNA上を動く様子をサブミリ秒の時間分解能で撮影した。この測定には、昨年度開発した、サブミリ秒の時間分解能を持つ分子蛍光装置とDNA整列固定技術“DNAガーデン”を用いた。DNA上でのp53の時系列データには、DNAと接触した状態で移動する“スライディング”に加えて、短い距離の“ジャンプ”が含まれているこが明らかとなった。従来の方法では“ジャンピング”が時間平均により“スライディング”の中に埋もれ、検出することが難しいが、マイクロ秒の分解能での計測により“ジャンピング”を“スライディング”から分離して検出することに成功した。
次に、障害物のあるDNAにおいてp53がDNA探索時に障害物を回避する仕組みとして、あるDNAから別のDNAへ移動する“セグメント間移動”が考えられる。そこで、“セグメント間移動”を検証するため、DNAガーデン法を改良し、ガラス基板上に2本のDNAを十字に固定する方法を開発した。ガラス基板上に作成した十字DNAと単分子蛍光装置を用いて、蛍光色素修飾p53がDNA間を移動するかを検証した。その結果、p53はDNA間を高速で移動することが明らかとなった。他のDNA結合タンパク質のセグメント間移動の速度を比較したところ、p53は1桁以上速くDNA間を移動できることが分かった。さらに、p53変異体の計測により、p53の高速セグメント間移動はプラスの電荷をもった天然変性領域によって達成されることが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに、マイクロ秒の分解能を持つ単分子蛍光顕微鏡とDNA整列固定技術DNAガーデンを開発し、がん抑制DNA結合タンパク質p53がDNA探索時に障害物を回避する時に必要な“ホッピング”や“セグメント間移動”することが明らかとなった。今後、実際に、障害物を配置したDNAを用いて、p53がDNA探索時に障害物を本当に回避できるのかを検証する。
具体的には、DNAガーデン法によりガラス基板に固定されたDNA上にDNA結合タンパク質FisやNhp6Aなどの障害物を配置し、p53がそれらの障害物を回避しながら動く過程を観測する。この際、蛍光色素で修飾しない障害物タンパク質を用いるため、蛍光色素で修飾されたp53の動きだけを可視化し、障害物回避における“ホッピング”の役割を明らかにする。FisやNhp6Aなどの障害物タンパク質は、大腸菌で発現させ、イオン交換やサイズクロマトグラフィーなどを用いて精製する。
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| Causes of Carryover |
（理由）
マイクロ秒の時間分解蛍光顕微鏡の作成に関して、既存の光学部品（レンズや光学フィルターなど）を用いて顕微鏡を組み立て試作品の性能の評価を行った。その結果、当初の計画で購入する光学部品を導入する前に、目的のマイクロ秒の時間分解を達成した。今後、顕微鏡の光学部品（レンズや光学フィルター）を購入し、顕微鏡を完成させる予定である。
（使用計画）
マイクロ秒の時間分解蛍光顕微鏡を完成させるため、レンズや光学フィルターなどの光学部品を購入する。また、障害物となるタンパク質の作成、蛍光色素の修飾のための消耗品として使用する。
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