2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K07319
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
今元 泰 京都大学, 理学研究科, 准教授 (80263200)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | アレスチン / G蛋白質共役型受容体 / GPCR / 自己会合 / X線溶液散乱法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アレスチンはリン酸化したG蛋白質共役型受容体（GPCR）に結合し、その活性を停止させる調節蛋白質である。アレスチンのサブタイプによって受容体選択性やリン酸基特異性に大きな違いがあるが、受容体との結合に関与するアミノ酸残基や立体構造にサブタイプ間で大きな違いはなく、これらの単純な比較から選択性の違いを説明することはできていない。そこで本研究では、アレスチンの自己会合性がサブタイプ間で異なることに着目し、選択性の違いが自己会合性の違いに起因するのかを検証することを目的とする。
アレスチンの多量体形成が選択性に寄与すると仮定すると、その原因は多量体中でフィンガーループやC末端部結合部位などの結合インターフェイスが、隣接するプロトマーによって遮蔽されているためであると予測される。そのため、多量体の4次構造を決定し、そのインターフェイスを明らかにすることは、GPCRとの相互作用メカニズムを明らかにするために重要である。そこで28年度は、溶液試料を用いて蛋白質の会合を直接観測することができるX線溶液散乱法を用いて、桿体アレスチンの自己会合について詳細に検討した。従来の研究では、構造情報を含まない最小角側（ギニエ領域）の解析から見かけの分子量を見積もり、会合数について検討していたが、今回はギニエ領域よりも広い散乱角の散乱データを用いて、プロトマー配置を検討することを試みた。また、アレスチンの活性化と自己会合性の関連を解析するため、構成的活性をもつ桿体アレスチンのスプライスバリアントであるp44を、大腸菌を用いて調製することを試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請書では、ギニエ領域よりも高角側のX線散乱を精度よく測定し、構造情報を得ることを計画していた。SPring-8で実験を行い、ほぼ計画通りの実験データを得ることができた。得られたデータを平衡式にもとづいた特異値分解法を用いることで、純粋な多量体の散乱パターンを得ることを試みたが、アレスチンのアグリゲーションによる散乱のため、小角側のデータを用いることができなかった。次年度では高角側のデータから構造情報を抽出する解析法を検討する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
アレスチンはロドプシンのリン酸化したC末端部と結合することで構造変化し、フィンガーループが露出する。そのため、プレカップル複合体でアレスチンの構造変化が起こるかどうかについても選択性がある可能性がある。従来の小角X線散乱測定では、複合体全体としてX線散乱を解析しているため、アレスチン分子の構造変化は検出することが困難であると思われる。そこで、29年度にはフーリエ変換赤外分光法を用いることを計画している。
また、桿体アレスチンとの比較のため、ウシ錐体由来のアレスチンを大腸菌で発現させることを試みたが、物性解析に必要な量を調製することができなかった。錐体アレスチンは桿体アレスチンと比べて不安定であるため、変性して不溶性画分に含まれてしまい、水溶性蛋白質として回収できなかったことが原因であると考えられる。そこで、培養温度を下げる、あるいは遺伝子発現を誘導するIPTGの濃度を下げるなどして蛋白質合成を遅くし、フォールディングが十分行えるような条件を探索する。
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