2016 Fiscal Year Research-status Report
排出過程におけるABC輸送体―基質相互作用を捉える
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16K07320
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山口 知宏 京都大学, 薬学研究科, 助教 (80346791)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ABCトランスポーター / P糖タンパク質 / 基質相互作用 / 立体構造解析 / 膜タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．P糖タンパク質ホモログ変異体のX線結晶構造解析
申請者らはこれまでに、P糖タンパク質ホモログの構造機能解析から、基質輸送前の状態である内向型構造を安定化し、外向型構造になりくくしていると予想される2つの膜貫通ヘリックス間の相互作用を予測していた。本年度は、この2つの膜貫通ヘリックスを引き離すことで内向型を不安定化し、内向型以外の状態を捉えることが可能かを明らかにするために、膜貫通ヘリックス間に嵩高い側鎖のTrpを導入した変異体を作成してX線結晶構造解析を実施した。まず、変異体タンパク質を精製して結晶化を行ったところ複数の条件で結晶が得られた。そこで、X線回折データを収集して構造解析を行った結果、変異体の結晶構造を3.2 オングストロームで決定することができた。この結晶構造を野生型の内向型構造と比較したところ、導入したTrpの側鎖によって当該膜貫通ヘリックス間が野生型より離れ、外向型構造に近づいていることが判明した。したがって、本研究のアプローチによって基質輸送過程の途中状態を捉えられることが示唆された。
２．P糖タンパク質ホモログの構造変化に寄与する部位の変異体の取得と機能解析
P糖タンパク質ホモログの構造変化に寄与すると予想されるアミノ酸残基をAlaに置換した部位特異的変異体を作成し、アミノ酸変異によるATPase活性と基質輸送活性への影響を調べた。その結果、いくつかの変異体はATPase活性がそのままに、基質輸送活性が著しく減少していることが判明した。変異導入したアミノ酸はATPの結合を基質排出ゲートの開放に伝達すると予想される膜貫通ヘリックスにあることから、これらの変異体は排出ゲートが開かず、基質が途中で留まりやすくなっている可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、P糖タンパク質の基質輸送過程の途中状態を捉えることによって、基質が構造変化に作用するしくみを明らかにすることである。これまでの研究から、P糖タンパク質が最も安定であり基質が結合する前の状態である内向型を不安定化する変異体を用いて、内向型とは異なる状態を捉えることができた。さらに、アミノ酸変異によって構造変化の伝播が途中で途切れたことを示唆する結果が機能解析から得られている。したがって、これらのアプローチ法を進めることでP糖タンパク質が基質を内部に抱えた状態を捉えられるものと期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、P糖タンパク質に基質が結合した輸送途中状態での構造解析を目指して、得られた変異体を改良し、基質との複合体結晶を作成する。本年度の研究によって、構造解析を実施したP糖タンパク質ホモログの変異体が基質結合に適した状態に近づいていることが示唆された。さらに、基質がタンパク質内部に留まりやすいことが示唆される変異体を見出した。これらの変異体をベースに、アミノ酸変異導入位置の修正および基質との相互作用解析によって、基質親和性が高い変異体を選別し、基質との共結晶化を実施する。
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| Causes of Carryover |
当初、P糖タンパク質と基質との相互作用解析のために、すでに作成していたTrp変異体を用いてTrpの蛍光変化による親和性測定を行う計画であった。しかし、この変異体は熱安定性が低いことが判明した。次年度使用額が生じた理由は、このTrp変異体の改良と性状評価を行う必要が生じ、計画していた相互作用解析を実施することができなかったためである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記の問題について、熱安定性の低下の原因となっていたTrp残基を同定し、改良型Trp変異体を取得することができたことから、次年度に繰り越した研究費は相互作用解析を行うために使用する。
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