2017 Fiscal Year Research-status Report
ヒト癌抑制遺伝子候補101F6によるレドックス擾乱細胞死誘導機構の解明
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16K07323
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
鍔木 基成 神戸大学, 理学研究科, 教授 (00145046)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木村 哲就 神戸大学, 理学研究科, 特命講師 (70506906)
武内 総子 神戸大学, 理学(系)研究科(研究院), 研究員 (00448169)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 膜タンパク質 / 電子伝達 / ヘム / アポトーシス / ナノディスク / シトクロムb561 / アスコルビン酸 / 生体膜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト染色体3p21.3領域に存在する101F6遺伝子は顕著な癌抑制作用を示す事が知られているが、その分子機構については不明である。101F6遺伝子産物は2個のヘムｂを含有する膜貫通型タンパク質で b561ファミリーの一員であることから、アスコルビン酸(AsA)あるいはモノデヒドロアスコルビン酸(MDA)ラジカルが関与する生体膜貫通レドックス反応がその生理機能発現に深く関与していると思われる。本研究ではAsA/MDAラジカルによる生体膜内外でのレドックス擾乱をプログラム細胞死へと導く細胞内メッセージとして捉え、その細胞死シグナルを生体膜（ER膜）において発生・制御する素子としての101F6タンパク質の役割と分子機構を解明することを目的としている。
我々はメタノール資化性酵母Pichia pastorisによる101F6タンパク質発現系を用い、大量発現と高純度精製方法を確立した。並行して、ヒト癌組織由来のA549細胞を培養し、界面活性剤DDMあるいはβ-OGにより細胞抽出液を調製・回収した。細胞抽出液と精製101F6タンパク質を充分に混和した後、101F6タンパク質を特異的に認識・結合する抗体を用いた磁気beads抗体法により、101F6タンパク質と相互作用すると思われるいくつかのタンパク質をSDS-PAGEと銀染色法で解析した。この解析方法によって再現性のある結果を得るためには、101F6タンパク質と界面活性剤とのミセル状態のままでは、たとえ精製したタンパク質を使用しても必ずしも生体膜中でのタンパク質間相互作用を反映していない可能性がある。そこで生体膜の非常に良いモデルであるナノディスク環境中に101F6タンパク質を再構成させた状態で免疫沈降・解析する計画を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
101F6タンパク質も他のb561ファミリーメンバーと同様に生体膜(おそらくはER膜）貫通構造を保持していることから、膜貫通電子伝達反応を利用した分子生理機能を持つと推定される。このことが癌抑制遺伝子としての生理機能発現に必須であるならば、101F6はこれまでの癌抑制遺伝子のものとは非常に異なる機構に基づいて機能していることになる。神経型あるいは植物型b561の場合、AsAとの結合部位を構成する細胞質側ヘムのHis配位子近傍には保存性Tyr残基やLys残基が存在するが、101F6の場合、それらはPheとAla残基に置換されている。これら残基をそれぞれTyrとLysに戻してやると、神経型あるは植物型b561に特徴的な生化学的性質(電子伝達のpH依存性、DEPCとの反応性の復活とそれによるAsAからの電子伝達阻害）を示すようになる。この結果はAsA/MDAラジカルのと反応性がヘム周辺・基質結合部位の微細な分子構造の変化により制御可能であることを示してる。現在、ヒト由来培養細胞中における101F6遺伝子の機能についての細胞生物学的解析、特に101F6タンパク質との相互作用に重点をおいたプロテオーム解析を行っている。これらの解析には再現性の問題など、いろいろ困難を伴う。具体的には101F6タンパク質を界面活性剤で可溶化したミセル状態のままでは、いくら高純度に精製した状態であっても、本来の生体膜中でのタンパク質間相互作用を反映していない可能性がある。そこで、生体膜の非常に良いモデル系であると考えられるナノディスク環境中に101F6タンパク質を再構成させた状態で免疫沈降をする計画を進めている。既にナノディスク作成に必要な2種類のMSPタンパク質の発現・精製を終え、101F6タンパク質との再構成とFPLCによるゲルろ過クロマトグラフィーによる精製にも成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
101F6はb561ファミリー中のTSF型に属するが、非常に特異な性質を持っている。①TSF型サブファミリー中でのアミノ酸配列の保存性が下等動物から高等動物に渡って非常に高いこと、②神経系型や植物型b561にはAsA/MDAラジカルとの結合及び電子伝達に関与すると思われる保存配列が存在するが、TSF型ではこれらの配列は保存されておらず、替わって別の非常に良く保存された配列が存在する。これは101F6がAsA/MDAラジカル以外の酸化還元基質との間で電子伝達反応を行っているか、あるいはAsA/MDAラジカルと電子伝達反応を行う場合であっても、その分子機構が非常に異なっている事を示唆している。b561ファミリー内で独自の進化を遂げた101F6は膜貫通レドックスセンサーとして機能することにより細胞内外でのシグナル伝達機構に深く関わっている可能性が高い。既に野生型101F6タンパク質はb561ファミリーメンバーとしての基本的性質を保持していること(2個のヘムを含有し、AsAからの早い電子受容反応を行いうること）を明らかにしているが、③MDAラジカルへの電子供与が非常に速い、④電子伝達反応のpH依存性が他のb561とは異なる、等が異なっている。これらの特異な性質の原因として、上に挙げた特異な保存配列の寄与が考えられる。よって保存性部位に対する部位特異的変異体を作成し、その影響を可視吸収、EPR、Stopped-flow、酸化還元電位測定により解析する。さらに生体膜の非常に良いモデルであるナノディスク環境中に１分子の101F6タンパク質を再構成させた状態でのこれらの測定・解析を行う予定である。同時により詳細な分子機構を理解するためには高分解能X線結晶構造の情報が不可欠である。このため、Lipidic Cubic Phase（LCP)法を用いた高純度結晶の作成に挑む。
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| Causes of Carryover |
(理由）H29年度に101F6タンパク質の高純度結晶の作成を目指していたが、野生型101F6タンパク質の発現と精製が計画通りに進行しなかったため、LCP法による結晶化に要する研究費使用を後年度に回すことにした。
(使用計画）H30年度において、当初の計画通りにH29年度分の研究内容（野生型101F6タンパク質の発現と精製、LCP法による結晶化)を進展させる予定である。
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Research Products
(15 results)
