2016 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
16K07326
|
|---|
| Research Institution | Jichi Medical University |
|---|
Principal Investigator |
柴山 修哉 自治医科大学, 医学部, 教授 (20196439)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | ヘモグロビン / アロステリー / X線結晶構造解析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
1）光励起分光測定システムの構築と性能評価： 設備備品として導入したパルスレーザーと現有の顕微分光光度計及びクライオ装置の組み合わせから成るタンパク質結晶用光励起分光測定システムを構築した。この年度は、比較的量子収率の高い光感受性タンパク質の一つである光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)単結晶を用いた予備的実験を行い、室温および低温下でのPAC結晶の吸収スペクトルの光応答を観測すると共に、この光励起分光測定システムの性能を評価した。
２）Relaxed（R）状態CO結合型ヒト・ヘモグロビン結晶の形状変換： R状態CO結合型ヒト・ヘモグロビンの結晶は容易に結晶化できる。しかしながら、結晶の形状がコロコロした８面体であるため、どの方向からも光解離用レーザーが通りにくい難しさがある。この問題を回避するため、蒸気圧を保ちつつ結晶化溶液を薄く広げ、厚さを制限したバッチ法を行い、形状を平板形に変えた結晶を調製した。
３）Tense（T）状態CO結合型ヒト・ヘモグロビンの調製： 通常のT状態デオキシヘモグロビン結晶にCOが４個結合すると四次構造変化（T-R転移）が起こり結晶は壊れる。T状態CO結合型ヘモグロビン結晶を安定化するため、ヘモグロビンのα鎖あるいはβ鎖いずれか一方のサブユニットのFe(II)ヘムのみをO2やCOと結合しないNi(II)ヘムに置き換えた2種類の金属置換混成ヘモグロビン（COが２個だけ結合したヘモグロビン分子）を調製し凍結保存した。次年度以降、これらの試料を用いて、安定なTense（T）状態CO結合型ヒト・ヘモグロビンの結晶化を行う。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究を進める上で必須のクライオ装置の本学への移設時期が予定よりも遅れた（年度半ばとなった）ため、研究全体の進行が若干遅延した。しかしながら、本年度の最重要課題である「低温対応のタンパク質結晶用光励起分光測定システムの構築」は年度内に達成することができ、今後の研究遂行に支障はないと考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画通り、本年度構築した低温対応のタンパク質結晶用光励起分光測定システムを用いて、各種ヘモグロビンの光解離収率の測定を行う。これと並行して、昨年度進行の遅れたT状態ヘモグロビン試料の結晶化を進める。また、これらの結晶試料と実験室系結晶分光データを基礎にして、放射光での時分割単結晶X線回折測定へと進む。100-140Kでの高繰り返しパルスレーザー照射法に関しては、この方法論の先駆者である連携研究者の佐藤（旧姓富田）との協力体制で進める。
|
| Causes of Carryover |
クライオ装置の移設作業が予定よりも遅れ、研究全体の進行が若干遅延したため、タンパク質精製及び結晶調製実験に計上していた消耗品費の使用時期が遅れた。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
開始の遅れたタンパク質結晶試料調製実験を光解離実験と並行して進める。
|
