2017 Fiscal Year Research-status Report
微小管上を歩行する細胞質ダイニンの分子内相互作用の解明
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16K07327
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
今井 洋 大阪大学, 理学研究科, 助教 (60391869)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 分子モーター / 微小管 / 構造生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトを含めた真核生物は数多くの細胞から構成されていて，様々な物質が，細胞内で能動的に輸送されている．多くの人が住んでいる大都市を１細胞と例えると，その中でトラックを使って食料品や生活雑貨が輸送されていることと類似している．この輸送が滞ると大都市では生活が成り立たなくなるのと同様に，細胞内での輸送が滞ると細胞に傷害が発生したり，重篤な場合には細胞死へと至る． 細胞質ダイニンは微小管と呼ばれる細胞骨格に沿って，細胞内輸送を行うので，例えば，神経細胞で細胞質ダイニンの輸送が滞ることと神経変性疾患と関連することが明らかとなっている．
ダイニンは，化学エネルギーである ATPを加水分解して，得られたエネルギーを力学的な仕事に変える蛋白質である． また，細胞質ダイニンは，ホモ２量体であるので，細胞質ダイニンはあたかもヒトが二足歩行するように運動するだろうと推定されている．
これまでに，１量体のダイニン構造は原子分解能（0.28 nm）で明らかにされている．しかし，１量体のダイニンと２量体のダイニンでは，様々な生化学的な性質が違うことが知られている．そのため，２量体の活性状態の構造は，１量体の構造からは推測的できない．
そこで，私たちは，ATPを加水分解して，ダイナミックに微小管上を移動している生理学的に最も重要な機能中の細胞質ダイニンを瞬間凍結し，凍結状態のまま電子顕微鏡で観察して，その２つのモータードメインの相互作用を明らかにすることを目指して，研究している．
昨年度は凍結条件をこれまでより生理学的な条件で凍結を行うことに成功した． その結果，これまでと違う新たな構造を示唆するデータを得つつある．今後はデータ数を増やして，論文にまとめたいと計画している．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度は凍結条件をこれまでより生理学的な条件で凍結を行うことに成功した．これまでは実験の技術的な困難さから，ATP存在しない状態で，細胞質ダイニンを微小管に結合してから，ATPを与えて，歩行を開始させた後に凍結していた． 一方で，細胞内には常にATPが存在するので，ATPをダイニンにあらかじめ与えておき，ATP存在下でダイニンが微小管に結合して歩き始める方がこれまでより生理学的な条件で撮影できると考えられる．現在，その方法で，多数の撮影を行っている．
また，昨年度は画像解析のためのワークステーションを購入して，電顕解析ソフトのRelion2, CTFFIND4, MotoinCor2などを使って計算を開始している．その結果，これまでと違う新たな構造を示唆するデータを得た．現在，データ数を増やしている．
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までに得られた画像から微小管に結合した細胞質ダイニンを多数得ている．これらの数を増やして，微小管上にどのような２つのモータードメインの距離分布でモーターが結合しながら歩行を行っているかを明らかにしていきたいと計画している．
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| Causes of Carryover |
今後，研究結果を論文にまとめるには，まだデータが少ない．データを増やしていき，これまでに得られているデータの信頼性を増す必要がある．このために，クライオ電子顕微鏡で観察する試料を生産する必要がある．具体的には，「ダイニン」タンパク質の細胞性粘菌を使った発現・精製のための試薬などの消耗品が必要である．それに加えて，クライオ電子顕微鏡で観察するための試料をのせるためのグリッドなどの消耗品が必要である．また，クライオ電子顕微鏡の使用料を支払う必要がある．そして，学会に参加する費用と論文投稿のための費用を計画している．これらの研究に必要な費用のために，次年度の予算を申請いたします．
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