2016 Fiscal Year Research-status Report
構成因子間の相互作用を介したγ-チューブリン複合体の微小管形成能獲得メカニズム
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16K07334
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
春田 奈美 東北大学, 生命科学研究科, 研究支援者 (70381671)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 微小管 / ガンマチューブリン / 中心体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
γ-チューブリン複合体は、微小管のマイナス端に結合し、その形成鋳型となる。そのためγ-チューブリン複合体の局在化と活性化のメカニズムを知ることは、微小管ネットワ－クの動態を理解する上で重要である。
本研究では、γ -チューブリン複合体の制御メカニズムを明らかにするために、線虫C. elegansの γ-チューブリン複合体の結合因子に焦点をあて、その役割をin vivoとin vitroからの解析を目指している。申請者は、線虫においても小タンパク質MOZART1γ-チューブリン複合体のコアサブユニットの一つであるGIP-1/GCP3のN末端に結合することをこれまでに示しており、この相互作用がγ-チューブリン複合体の制御に直接関与すると考えた。そこでMOZART1が結合できないN末端欠損GIP-1変異体（GIP-1ΔN）を発現する線虫株を作成し、in vivoでの挙動を解析した。GIP-1ΔN変異体は、野生型GIP-1存在下では、中心体へリクルートされたが、野生型GIP-1をRNAiでノックダウンすると、局在できなくなった。これらの結果は、GIP-1ΔNでもγ-チューブリン複合体に取り込まれることは可能だが、GIP-1のN末端領域とMOZART1との相互作用が、中心体への局在化には必須であることを示唆している。今後は、GIP-１の野生型およびGIP-1ΔNとのMOZART1の融合タンパク質を発現するコンストラクトを作成し、γ-チューブリン複合体の活性化及び局在化に必要な条件を絞り込む予定である。
さらにイーストツーハイブリッド法を用いて、γ-チューブリン複合体の構成因子間の相互作用を調べた。GIP-1と結合するGIP-2/GCP-2が、所属研究室で同定したγ-チューブリン複合体新規構成因子のGTAP-1, GTAP-2とそれぞれ結合することを明らかにした。これらの知見を元に、in vitro 再構成系の構築を続ける。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
γ-チューブリン複合体の構成因子であるGIP-1/GCP3とMOZART1のin vivoによる細胞内挙動解析は、GIP-1/GCP3のMOZART1結合部位であるN末端欠損変異型の解析を終えている。さらに、MOZART1とGIP-1/GCP3の野生型およびN末端欠損型との融合タンパク質をトランスジーンとして線虫に導入するシステム系が完成し、線虫株の取得も順調に進んでいる。In vitroでの再構成系の実験は、現在、バキュロウィルスで発現し精製する上で、γ-チューブリン複合体構成因子の様々な組み合わせを検討している最中である
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| Strategy for Future Research Activity |
γ-チューブリン複合体の制御機構を明らかにする上で、その制御に直接関与するMOZART1とGIP-1/GCP3の融合タンパク質を用いたin vivoにおける挙動解析を進める。また、MOZART1の抗体を作成し、in vitroでのγ-チューブリン複合体の再構成系の確立を引き続き行う。再構成系には、γ-チューブリン複合体のコアサブユニットのみならず、所属研究室で同定した新規構成因子であるGTAP-1, GTAP-2も加えてその効果を、複合体の会合状態と微小管形成能を調べる予定にしている。さらに、γ-チューブリン複合体の中心体へのリクルートが、分裂期と間期で異なる因子が関わる可能性を見出しているので、その点についてもさらなる解析を進めていく予定である。
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| Causes of Carryover |
MOZART1の抗体作成の予算を計上したが、作成が遅れたために、今年度中にその分の予算を使用することができなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
MOZART1の抗体を作成するために使用する。
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