2017 Fiscal Year Research-status Report
細胞間コミュニケーションにおけるコンタクトアクティベーション機構の解析
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16K07343
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
斉藤 美佳子 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (20291346)
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| Project Period (FY) |
2016-10-21 – 2019-03-31
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| Keywords | コンタクトアクティベーション / Cx30.3 / マウスES細胞 / 細胞間コミュニケーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ギャップジャンクション構成タンパク質であるコネキシン群の網羅的解析の過程で、マウスES細胞ではCx30.3が隣接する細胞の細胞間接触部位のみに速やかに発現することを発見した。本研究は、コンタクトアクティベーションの機能を有するCx30.3の発現特性を明らかにすることを目的としている。本年度は、以下の２点を行った。
１．細胞接触応答の特異性の解析
ES細胞の細胞懸濁液を培養ディッシュの蓋にhanging dropを形成したものと、十分なピペッティングによりsingle cell化してディッシュに播種したものを培養し、一定時間後に細胞を回収してCx30.3の発現を解析したところ、hanging dropを形成したものは、通常培養時のコロニー状態の細胞よりも発現が上昇していた。一方、single cellの場合は通常培養時の細胞に近づくようにCx30.3の発現量は増加していった。また、異種細胞であるHeLa細胞あるいはメラノーマ細胞とES細胞の細胞懸濁液を用いてhanging dropを形成した場合、Cx30.3の発現上昇は認められなかった。これらのことから、Cx30.3は同種のES細胞接触により発現増加することがわかった。
２．Cx30.3発現増加におけるカドヘリンの関与
Cx30.3の発現変化は細胞接触に関わるカドヘリンが関与している可能性があるため、カドヘリンの細胞接着を阻害する抗体を培養液中に添加し、hanging drop及びsingle cellの形成から一定時間後のCx30.3の発現を解析した。その結果、hanging drop、single cellともに抗体を添加していない場合とは異なり、通常培養時に対してCx30.3は低い発現量を示した。これらのことから細胞接着の阻害がCx30.3の発現に影響を与えた可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
コンタクトアクティベーション機能を明らかにするためには、単に細胞を培養してコロニーを形成させた場合ではなく、細胞を接触させてCx30.3の発現増加が観察できることを確かめる必要がある。そこで、強制的に接触させる方法として培養ディッシュの蓋にhanging dropを形成させたところ、通常培養時のコロニー状態の細胞よりもCx30.3の発現が上昇していることを確認することができた。また、この発現増加はES細胞同士で起こることも確認することができた。
また、細胞接触に関与することが知られているカドヘリンの関与も解析することができ、Cx30.3の発現はカドヘリンシグナルの下流にあることが示唆された。既にLIFシグナルの下流にあることを明らかにしており、新たな細胞内シグナル伝達経路が存在する可能性を見いだすことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
Cx30.3遺伝子のプロモーターの最小領域の決定を行い、その領域に結合する転写因子を、ストレプトアビジンにビオチン標識したDNAを結合させた磁気ビーズを用いて探索する。また、細胞接触によるCx30.3発現増加のメカニズムを細胞内シグナル伝達の観点から解析を行い、コンタクトアクティベーション機構を洞察する。
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