ショウジョウバエ初代培養血球細胞で観察される細胞キラリティの形成機構の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07349
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 笹村 剛司 大阪大学, 理学研究科, 助教 (70647487)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 細胞キラリティ / 貪食細胞 / 細胞骨格

Outline of Annual Research Achievements

私は、新規に発見したショウジョウバエ貪食細胞のキラリティがどのように形成されるか、その分子メカニズムを明らかにするため、アクチン繊維の動態を観察しました。具体的には、ショウジョウバエ貪食細胞に、アクチン繊維に特異的に結合するマーカーとして広く用いられているLifeAct-GFPを発現させ、共焦点顕微鏡によるライブイメージングを行いました。詳細な観察の結果、貪食細胞のフィロポディア内に存在しているアクチン繊維が、回転運動をおこなっていることが明らかになりました。この結果は、貪食細胞における細胞キラリティがアクチン繊維の動きそのものに由来している可能性を強く示唆しており、貪食細胞内での細胞キラリティの生成機構を解明するために、大きな発見であるといえます。さらにこの発見は、フィロポディア内のアクチン繊維が一定方向に回転することによって、細胞内に一定方向の流れができるというキラリティ形成の分子機構を示唆しています。
さらに私は、貪食細胞の細胞キラリティの形成機構の大きな役割を果たしていると考えられるMyo31DFにHaloタグを付加したコンストラクトを作成し、貪食細胞で発現することにより、Myo31DFタンパク質の一分子解析を行いました。その結果、細胞内での一定方向への動きなど、Myo31DFタンパク質自体の挙動が、キラリティを示すことはありませんでした。しかし、Myo31DF分子の挙動は、哺乳類のMo31DFオルソローグであるMyo1dの挙動によく似ていることが明らかになりました。このことは、Myo31DFがMyo1dと同じ分子機構で機能していることを示唆します。Myo1dはアクチンと、負の電荷のある脂質に結合し機能していることが知られていることから、Myo31DFも同様である可能性が明らかになりました。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画では、RNAiにより細胞キラリティを形成する分子を同定する計画でした。しかしながら、貪食細胞のフィロポディア内のアクチン繊維が回転していることが明らかになったため、まずは、この回転がどの方向に回転するかを決定するための研究を行うことにしました。理由としては、フィロポディア内のアクチン繊維がどのように形成されているのかについては、多くの知見があり、どのような分子が関わっているかすでに明らかになっているためです。すなわち、フィロポディアの関与を調べることで、どのような分子がキラリティ形成に機能しているのかも明らかになります。このことは、RNAiによるスクリーニングが不要である可能性を示しており、研究方法を変えることにしました。現在、今後の研究の推進方策に記入したアクチン繊維の回転方法を決定するための、様々な方法の計画を立て実行しており、それのため必要な実験、たとえば、Photo-conversionタイプの蛍光タンパク質コンストラクト、UAS-LifeAct-mEOS3.2の作成などを行いました。
Myo31DFのHaloタグコンストラクトの作成による一分子イメージングは予定通り、作成および解析が終了しました。その結果は、予想とは異なりましたが、I型ミオシンの分子機能そのものが、種を超えて保存されていることが明らかになりました。また、Myo31DFの一分子イメージングにより、Myo31DFがアクチン繊維と細胞膜に結合し機能していることが示唆されています。この結果は今後さらにMyo31DFの分子機能をどのように解析していくかの指針と、キラリティスイッチとしてのMyo31DFの機構のモデルを考えていく上で重要な知見です。
これらの結果を受け、研究が予定通り、順調に進んでいると考えています。

Strategy for Future Research Activity

今後取り組むべき最大の課題が、フィロポディア内のアクチン繊維の回転方向の決定です。これが、一定方向なのか、そしてMyo31DF突然変異細胞内でどのようになっているかは、キラリティ形成の分子機構を明らかにするための大きな鍵となります。そのために私は以下のような複数の方法を考えています。1つめは、青色光の照射により、蛍光の波長を変化させることが可能な蛍光タンパク質を発現させることで、フィロポディア内のアクチン繊維の一部のみをマークし回転方向を決定する方法です。2つ目はより解像度の高い顕微鏡を用いる方法です。特にz軸方向の解像度を高めるため、超高解像度顕微鏡のひとつであるSIMによるタイムラプス撮影を考えています。3つ目は私の研究室で所有するx-y方向に解像度の高いAiry scan共焦点顕微鏡で回転方向を決定するために、樹脂に詳細な凹凸をプリントした基盤を用いて、細胞を垂直に接着させ、z軸方向をx-y平面に変換することで、回転を決定する方法です。これらの方法を、同時並行で行っていくことで、回転方向を決定できると考えています。
また、Myo31DFの一分子としての機能を明らかにするためには、比較対象となる一分子の動態が必須であると考えています。しかしながら、現在までにショウジョウバエの細胞を用いて、一分子の動態を研究した論文はありません。そこで、Myo31DFと動態を比較するために、新たにMyo31DFと同様にI型ミオシンをコードするMyo61F、細胞の運動や分裂などさまざまな細胞の機能に関与しているII型ミオシン、細胞膜貫通タンパク質（CD4）のHaloタグコンストラクトを作成し、一分子イメージングを行うことで、それぞれの分子挙動を決定します。それらを、Myo31DFの動態と比較することで、Myo31DFの分子機能を明らかにしていきたいと考えています。

Causes of Carryover

来年度に、物品をより多く購入する必要があるため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

物品費として使用。