2019 Fiscal Year Research-status Report
ショウジョウバエ初代培養血球細胞で観察される細胞キラリティの形成機構の解明
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16K07349
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
笹村 剛司 大阪大学, 理学研究科, 講師 (70647487)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞キラリティ / II型ミオシン / アクチン細胞骨格 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに申請者は、中心体の回転方向に時計回りのキラリティが存在し、MyoID変異細胞で回転方向が反転すること、そして同様の回転キラリティがラメロポディアのアクチンフィラメントの移動にも存在していることを明らかにしました。
そこで、血球細胞のキラリティ生成の分子機構を明らかにするために、アクチン制御分子の機能阻害実験を行いました。培地に、さまざまな阻害剤を添加し、血球細胞の中心体の回転方向を決定しました。その結果、多くのアクチン制御分子の阻害剤が中心体の回転に影響を与えることがわかり、それらの中で、申請者はII型ミオシンに着目しました。II型ミオシンの阻害剤の添加により、中心体の回転方向がランダム化します。この結果を確認するために申請者は血球細胞にII型ミオシンの調節軽鎖のRNAiにより、その機能を抑制しました。2種類の独立のRNAiを用いた結果、どちらの場合も中心体の回転方向のキラリティが鏡像化することが明らかになりました。興味深いことに、II型ミオシンの機能阻害はアクチンフィラメントの回転方向には影響がないこともわかりました。
以上の結果は、血球細胞のキラリティの形成にII型ミオシンの機能が重要であり、アクチンフィラメントにより形成されているキラリティの下流もしくは並行して存在していることが示唆されました。この結果は、研究の一つの大きな目標である細胞キラリティ形成の分子機構の一部を示すものであり、有意義な結果であると言えます。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度は薬剤によるアクチン制御分子の阻害実験を引き続き行いました。アクチン重合、II型ミオシン、Arp2/3複合体、フォルミン、ROCKの阻害剤による機能阻害実験を行った結果、すべての薬剤で中心体の回転に影響が生じました。それらの中で、Arp2/3複合体およびROCKの阻害剤をある濃度で加えた場合、血球細胞の中心体の回転方向が反転することが明らかになりました。このことは、Arp2/3複合体とROCKのキラリティ形成への関与を示唆していますが、濃度によって結果は一定ではなく、また薬剤がどこまで特異的であるのかは不明瞭な点があります。そこで、この結果を確認するために、RNA干渉法（RNAi）によりこれらの遺伝子の機能を阻害することを考えました。RNAiも対象以外の遺伝子の機能を抑制してしまう、OFFターゲットの問題があるため、独立な2箇所以上のRNAi系統で同じ表現型が出ることを確認しました。しかしながら、Arp2/3複合体ではRNAi系統により結果がばらつき、ROCKのRNAiでは明瞭な結果は出ませんでした。そこで、ROCKの下流遺伝子として重要な機能を果たしているII型ミオシンに着目しました。阻害剤による実験では、中心体の回転方向はランダム化していました。そこでMyoII重鎖のRNAiでは細胞が死んでしまい、機能を観察できませんでしたが、MyoII調節軽鎖のRNAiでは独立な複数のRNAiで中心体が反転することが明らかになりました。また、中心体と同様の回転キラリティを見出したアクチンフィラメントの回転方向にMyoIIのRNAiの効果がないことも明らかにしました。
以上の結果は、血球細胞キラリティがI型ミオシンだけではなくII型ミオシンによっても制御されていることを示唆しており、当初の計画とは異なっているものの着実に結果を出しているといえます。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、アクチンフィラメントとI型ミオシン、II型ミオシンがどのように細胞キラリティを形成しているのかを詳細に解析していきます。まず、これら3種類の分子がどのような順序で機能しているかを、キラリティが逆になる組み合わせにより、決定していきます。具体的には、MyoID過剰発現により中心体およびアクチンフィラメントの回転はより強く時計方向に回転します。反対にII型ミオシンのRNAiでは中心体は反時計方向に回転します。そこで、MyoIDの過剰発現とMyoIIのRNAiを同時に行い、どちらの表現型が観察されるかで、I型およびII型ミオシンがどのように機能しているか明らかにします。
また、今回、II型ミオシンがキラリティに重要であることが明らかになりました。しかしながら、II型ミオシンは双頭のフィラメントを形成するため、その構造上、キラリティを生じることができません。したがって、何らかの上流の分子機構がキラリティを形成していると考えられるため、その分子機構の探索を行います。具体的には、II型ミオシンを制御しているのは軽鎖のリン酸化であることが、多くの研究で明らかにされているので、このリン酸化酵素（MLCKやROCK）を制御している分子がどのように活性化されているかを、マーカーを用いて検証していきます。また、II型ミオシンが細胞内でどのように局在化しているか、それ自身にキラリティがあるのかといった問題を明らかにすることで重要な知見を得ることができると考えられます。
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| Causes of Carryover |
昨年度は、薬剤およびRNAiのスクリーニングに重点をおいたため、試薬等の物品費を予想よりも使用しませんでした。本年度は、培養細胞の飼育など物品費が多くかかるほか、論文を投稿する際に多額の費用がかかる可能性があるため、次年度使用額を生じさせることにしました。
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