2016 Fiscal Year Research-status Report
Mechanism of novel secretory vesicle formation by lipid membrane binding I-BAR proteins
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16K07351
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
末次 京子 (塙京子) 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教 (40391990)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 脂質膜 / 分泌小胞 / BARタンパク質 / 脂質膜切断 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ＢＡＲ (Bin-Amphyiphysin-Rvs161/167) タンパク質は脂質結合タンパク質である。ＢＡＲタンパク質は脂質膜の表面でＢＡＲドメイン同士が規則正しく重合することにより、脂質膜をチューブ様構造に誘導することができる。ＢＡＲタンパク質のサブファミリーの一つであり、細胞膜の突起構造を誘導するＢＡＲタンパク質は、ラメリポディアやフィロポディアに代表される細胞膜の突起構造形成に関与していることが知られている。本研究では細胞膜突起構造に関与するＢＡＲタンパク質は、これまで考えられてきたように単に脂質膜突起構造の誘導を行っているだけではなく、ＢＡＲタンパク質により誘導された細胞膜突起を切断し、細胞外分泌小胞形成を誘導しているのではないかと考え、その仮説を検証することを目的としている。
平成２８年度は脂質膜突起構造を誘導するＢＡＲファミリータンパク質遺伝子を、タンパク質発現系であるpGEX6pプラスミドにクローニングし、大腸菌による大量発現およびタンパク質精製を行うことが出来た。精製タンパク質を用いて、人工脂質膜との結合と脂質膜切断活性を調べたところ、これらのＢＡＲタンパク質は脂質と結合し脂質膜切断活性を持つことが示唆された。また、電子顕微鏡観察により、人工脂質膜がＢＡＲタンパク質により小胞化されていることも確認できた。さらにCRISPR/CAS9システムを用いて頭頸部がん細胞、グリオーマ腫瘍細胞、HeLa細胞の脂質膜突起構造を誘導するＢＡＲ遺伝子のノックアウト細胞を作製することが出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
申請書の研究計画に通り、脂質膜突起誘導型ＢＡＲタンパク質の大量発現系の構築、およびタンパク質の精製を順調に行うことが出来た。それらの試料を用いて、精製タンパク質と人工脂質膜との結合および脂質膜切断実験も行い、脂質膜突起誘導型ＢＡＲタンパク質の脂質膜結合活性と脂質膜切断活性を確認することが出来た。
脂質膜突起誘導型ＢＡＲタンパク質による人工脂質膜切断は、特定の脂質組成および脂肪酸の飽和度などが切断活性に影響を与えていることを示唆するデータが得られてきた。脂質膜突起誘導型ＢＡＲタンパク質の変異体を用いて検証を行ったところ、一部のＢＡＲタンパク質が持つ両親媒へリックスは脂質切断に影響を与えていないことも明らかになった。
また、CRISPR/CAS9システムを用いて、新たに頭頸部がん細胞、グリオーマ腫瘍細胞、HeLa細胞のIRSp53ノックアウト細胞を作製することが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に引き続き、脂質膜突起誘導型ＢＡＲタンパク質による脂質膜切断機構を分子レベルで明らかにするため、新たに作成した脂質膜突起誘導型ＢＡＲタンパク質ノックアウト細胞を用いて、脂質膜突起誘導型ＢＡＲタンパク質により細胞外分泌小胞形成が誘導されているかを検証する。そのため、脂質膜突起誘導型ＢＡＲタンパク質のGFP融合タンパク質の発現プラスミドを作成し、ノックアウト細胞にトランスフェクションする。それらの細胞の培養上精を回収し、超遠心法により細胞外分泌小胞を精製し、そこに脂質膜突起誘導型ＢＡＲタンパク質が含まれていないかをウエスタンブロッティングによって検出する。また、回収した細胞外分泌小胞はマススペクトル解析により調べる予定である。
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