2019 Fiscal Year Annual Research Report
The control of p97-mediated Golgi membrane fusion and the ubiquitination
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16K07353
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
近藤 久雄 九州大学, 医学研究院, 教授 (20205561)
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2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ゴルジ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゴルジ体と小胞体の形成維持の仕組みは大きく異なる。これら二つの小器官で働く膜融合機構としてp97ATPase経路を申請者は発見しているが、その作用機序は細胞内小器官において幾つかの点で異なる。中でも、ゴルジ体のみにおいて細胞分裂期における再構成でユビキチン（Ub)化修飾が必要である。我々は先に、p97ATPaseによるゴルジ体形成に必須な脱Ub化酵素VCIP135を発見しているが、昨年度までに新規のVCIP135結合因子（p40と仮に命名）を同定することに成功したので、本年度はその解析を行っている。
p40のリコンビナント蛋白質の大腸菌による調製は、通常の方法では不溶性となってしまい困難であった。そこでpCold系を用いた低温下での誘導によりnativeなものがとれることを見いだし、生化学的な今後の検討が可能になった。その一つとして、今現在このp40リコンビナント蛋白質をbeadsに固定してp40結合蛋白質の同定を試みている。
またp40リコンビナント蛋白質を抗原とし、p40にたいする抗体を作成した。この抗体を用いてp40の細胞内局在を調べたところゴルジ体と小胞体に存在していた。培養細胞においてp40発現をsiRNA法で抑制すると、ゴルジ体の縮小が認められた。この表現型は、アクチン脱重合剤サイトカラシンDを培養細胞に作用させたときの表現型と酷似していた。そこで念のため、p40siRMA処理した培養細胞でactin繊維の染色をしてみると、核周りのactin繊維が減少していた。加えて、可溶化したゴルジ体膜を用いて、抗p40抗体による免疫沈降を行った結果、actinが単離されてきた。
以上の結果から、p97ATPaseによる膜融合と細胞骨格の形成が強く関係している可能性が示唆されてきた。
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