2017 Fiscal Year Research-status Report
質量分析イメージング法による線虫C.エレガンスのシングルセルレベル脂質マッピング
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16K07355
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| Research Institution | Kanagawa University of Human Services |
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Principal Investigator |
木村 芳滋 神奈川県立保健福祉大学, 保健福祉学部, 准教授 (90274703)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 質量分析イメージング法 (IMS) / 線虫C.エレガンス / TOF-SIMS / メタボローム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではすべての細胞の位置と形が特定されている線虫C.エレガンスを用いてこれまで不可能であったシングルセルレベルで脂質の発現マッピングを行い，その環境変異と遺伝学的変異による変化プロファイルを明らかにすることで，これまでほとんどわかっていない脂質の局在の機能とその成立メカニズムを明らかにし，将来のヒトを用いた医学応用のための基礎技術の確立を目指す
本年度は研究の２年度目として，昨年度確定した軽度（30分程度）のパラホルムアルデヒド(PFA)固定後の凍結切片を用いて，TOF-SIMS法で線虫のイメージング解析を行った．野生型 (N2) とω3脂肪酸デサチュラーゼが欠損し、エイコサペンタエン酸 (20:5 n-3) などω3脂肪酸が合成出来ない線虫 fat-1変異体 の２種を比較解析した．試料は、10 keV Ar1000+をスパッタリングイオンビーム (TOF.SIMS5, ION-TOF GmbH) として、表面をクリーニングしたのち，60 keV のBi3++ を一次イオンとして測定した結果，N2とfat-1の間で二次イオン強度に差がある二次イオンピークが見つかった．また，いくつかのアミノ酸由来フラグメンイオンが，ある特定の組織に同様に偏在していることが分かった．
また，新たなデータ解析法として，TOF-SIMSデータに関しては各ピクセルにおける各二次イオン強度を，光学顕微鏡イメージ像に関しては画像データの各ピクセルにおける強度を変数とし，測定データを主成分分析(PCA)で解析し，元のTOF-SIMSデータよりも空間分解能の向上したイメージを得ることができた．また，解像度の異なる二次イオン像を融合させることで，高い空間分解能も維持できることが示された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度，安定度の高いパラホルムアルデヒド（PFA）固定後の凍結切片法の条件を検討し，最適な条件を決定することができたので，本年度は，この条件で作成した，線虫サンプルを用いて，ION-TOF社のシステムでイメージング解析を行った．その結果野生型とfat-1変異体で異なるピークを得ることができた．また，測定データを主成分分析(PCA)で解析することで，元のTOF-SIMSデータよりも空間分解能の向上したイメージを得ることができた．また，解像度の異なる二次イオン像を融合させることで，高い空間分解能も維持できることが示された．以上の結果から，本研究の目的とする細胞レベルでのイメージングに必要な条件が揃った．
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| Strategy for Future Research Activity |
PFA固定と凍結切片法を組み合わせた方法でTOF-SIMSに適したサンプルを作成し，アルバックファイ社，ION-TOF社のシステムに加えてOrbiSIMSのイメージングシステムを用いて，より精細な解析を行う．
野生型と脂質合成変異体の比較，温度などの環境条件の変化を検討することで脂質の細胞内局在の生物学的役割を明らかにする．
具体的には以下の順序で TOF-SIMS の高解像度イメージング解析を行う。
a)生体膜の脂質の分布図を器官ごとまた可能であれば細胞ごとに比較する．
b)新たに検討する準備法として，未固定線虫をフリーズドライしてガラス面状に静置した後，表面をスパッタリングしながら，線虫内部をZ軸に沿って露出する方法を試みる．
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| Causes of Carryover |
物品費の中で線虫の新しい系統の購入に関する費用と，線虫の維持管理に関する費用が予定を下回ったため，次年度使用額が生じた．主に物品費として線虫の維持管理に関する費用として利用する予定である．
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