2017 Fiscal Year Research-status Report
プロテオグリカンの糖鎖修飾を制御するゴルジ体ストレス応答経路の解析
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16K07356
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
吉田 秀郎 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (60378528)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ゴルジ体 / ストレス / 細胞小器官 / 糖鎖 / プロテオグリカン / 転写 / 小胞体 / 神経 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞小器官の量的調節機構は、細胞が自律的に機能するために必須のメカニズムであり、細胞生物学の重要な研究課題である。われわれは小胞体の量的調節機構である小胞体ストレス応答を明らかにした後、現在はゴルジ体の量的調節機構であるゴルジ体ストレス応答に取り組んでいる。これまでにゴルジ体の一般的機能を調節するゴルジ体ストレス応答のTFE3経路を明らかにした。本研究課題では、軟骨細胞などで多量に産生されるプロテオグリカンの糖鎖修飾を制御するプロテオグリカン経路の分子機構を解析している。
本年度は、前年度までに同定したエンハンサー配列PGSEに結合してプロテオグリカン経路を制御する転写因子の検索を行った。プロテオグリカン型糖鎖修飾酵素であるHS6ST1とNDST2、GLCE遺伝子のエンハンサー配列を用いて酵母one hybridスクリーニングを行った。様々なスクリーニング条件を試したが、転写因子の候補を単離することができなかった。これは、転写因子を構成するタンパク質が複数の遺伝子にコードされているためではないかと考えている。また、本年度はエンハンサー配列PGSEに関する論文発表のための追加実験を行った。HS6ST1とNDST2、GLCE、B3GAT3、CSGALNACT2遺伝子のエンハンサー配列に1塩基ずつ置換変異を導入し、エンハンサー活性に必要な塩基を同定したところ、CCGGGGCGGGGCGという配列(PGSE-A配列)とTTTTACAATTGGTCという配列（PGSE-B配列）が活性に重要であることを見出した。これらの配列は進化的にもよく保存されており、特にPGSE-A配列は様々なプロテオグリカン型糖鎖修飾酵素遺伝子のプロモーター領域に存在していることから、ゴルジ体ストレスによるプロテオグリカン型糖鎖修飾酵素遺伝子の転写誘導は共通の機構によって制御されていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
転写因子の同定が難しいことは、充分に想定内である。前年度から既に「今後の研究の推進方策」に示す方法によって転写因子やその他の制御因子を網羅的に同定することを始めている。また本年度は論文上梓のための実験をほぼ完了した。次年度は制御因子の同定に全力を尽くす予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
酵母one hybridスクリーニングによっては、PGSEに結合する転写因子を同定することは難しいことがわかった。そこで次年度は下記の方法によって転写因子やゴルジ体ストレスのセンサー分子などプロテオグリカン経路の制御因子を網羅的に同定することを試みる。
(1)GeCKOライブラリーと次世代シークエンサーを用いた制御因子の検索
プロテオグリカン経路の活性化剤xylosideで細胞を処理すると、細胞死が起こることがわかっている。従って、xyloside処理によっても細胞死が起こらない変異体細胞を単離することができれば、ゴルジ体ストレス応答の制御因子群を同定することができるはずである。そこで、ヒト遺伝子を一つずつ破壊したGeCKO細胞ライブラリーをxylosideで処理し、細胞死を起こさなくなった変異体細胞を単離する。破壊された遺伝子にはsgRNA由来の配列が挿入されているので次世代シークエンサーによって大量に読み取ることによって、変異体細胞群で破壊されている遺伝子を網羅的に検索し、プロテオグリカン経路の転写因子やセンサー分子などを一網打尽に同定する。
(2)siRNAライブラリーと画像解析を用いた制御因子の検索
PGSE配列にGFPをつないだレポーターをHeLa細胞に導入すると、ゴルジ体ストレスを与えた細胞ではコントロールの細胞に比べてGFPの発現が上昇する。もし、プロテオグリカン経路の制御因子の発現を抑制することができれば、ゴルジ体ストレスを与えた時のGFPの発現上昇は低下するはずである。そこで、ヒトの全遺伝子に対するsiRNAライブラリーを個別にHeLa-PGSE-GFP細胞に導入し、GFPの発現量を画像解析によって解析することで、GFPの発現上昇を抑制するsiRNAを検索する。この方法によっても、プロテオグリカン経路の制御因子を網羅的に同定することが可能である。
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Research Products
(20 results)
