2016 Fiscal Year Research-status Report
メダカ体幹部で一生涯ロバストに維持されるzic1発現境界形成メカニズム
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16K07364
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
島田 敦子 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (20376552)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | medaka / zic1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、発生初期は正常でありながら発生後期になって徐々に背側の体型、ヒレの形、色素パターンなどが全体として腹側化してしまうユニークなメダカDouble anal fin (Da)変異体を用いた研究から、体幹部では発生初期の背腹情報は、いったん体節に集約されてzic1/zic4(Daの原因遺伝子)のオン・オフという二値的情報に変換され、その後「改めて」、zic1/zic4を発現する体節細胞がヒレなどの体幹部の表皮組織を背側化へと誘導すること、またzic1は成体でも、体節に由来する器官（椎骨、筋節、真皮）の背側で発現が強く維持されており、その発現境界に特殊な細胞群（boundary cellと命名）が存在することを発見した。そこで本研究では、脊索レベルで一生涯明確に保たれるzic1/zic4発現境界がどのような機構で形成されるのかを明らかにすることを目指す。平成２８年度は、以下の２点を明らかにした。
1. zic1上流因子
体節形成期以降に様々なシグナル阻害剤を処理したところ、Wnt canonical pathwayの阻害剤IWR-1がzic１発現を低下させること、また、確かに神経管でwnt1, wnt3, wnt3aが発現しており、zic1の上流因子がwntシグナルであることがわかった。
2.Boundary前駆細胞の位置の特定
Boundary細胞の由来を調べるため、全身でDsRedを発現する胚(β actin-DsRed)の細胞を野生型胚に移植してキメラを作成し、Boundary細胞がラベルされた胚について映像を遡ることで前駆細胞の位置を調べたところ、体節の分節直後は脊索付近に位置していたことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画当初は、平成２８年度はzic1上流因子の同定とBoundary前駆細胞の位置の特定、さらにBoundary細胞で発現する遺伝子群を少数細胞RNA-seq法によって網羅的に検出する予定であった。前者２つは計画通りに進んだ。少数細胞RNA-seq法については、zic1-GFPの発現強度によってboundary細胞のみを選択する条件検討にとどまっているもののおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はBoundary細胞の可視化とBoundary細胞が分泌すると予想されるzic1上流因子の阻害因子を同定をめざす。そのために、Boundary細胞で発現する遺伝子群を少数細胞RNA-seq法によって網羅的に検出する。具体的にはzic1:GFP Tg胚のBoundary細胞がGFP(zic1)を強く発現することを利用してフローサイトメトリーによって分画し、quarts-seq法（Sasagawa et al., 2013）によりcDNAを増幅、MiseqおよびHiseq1500を用いて配列決定する。その後イルミナのfastqを用いて配列のマッピング、遺伝子タグ数を算出する。タグ数をRにおいてTCC プラグインを用いてノーマライズする。
これらRNA-seq法で同定された遺伝子群の中からマーカとなりうるものを特定し、その調節領域用いてトランスジェニック（Tg）を作出する。ライブイメージングにより、この細胞がどのように境界構造を作るか追跡する。
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| Causes of Carryover |
平成２８年度の研究には、これまで当該研究室に購入済みであった試薬を主に用いたため（次年度の実験は高価な試薬を必要とするため、これに備えた）。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成２９年度は、少数細胞RNA-seqを行うため、比較的高価な試薬を購入予定である。
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