2017 Fiscal Year Research-status Report
両生類で発見された新たな胚体起源に由来する骨髄球の性状と発生意義
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16K07367
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
前野 貢 新潟大学, 自然科学系, 教授 (10190315)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 尚志 早稲田大学, 教育・総合科学学術院, 教授 (80350388)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 骨髄球 / 両生類 / アフリカツメガエル / ミエロペルオキシダーゼ / 中腎 / 血球幹細胞 / AGM領域 / 尾部 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アフリカツメガエル生後７日の幼生の中腎原基付近（成体の血球の分化領域）に集積している骨髄球の出現の生理学的意義を明らかにすることを目的として、H29年度は、骨髄球の分化に主要な役割を担っていると考えられているg-csfr（granulocyte-colony stimulating factor receptor）遺伝子の発現阻害実験をおこなった。
第一に、g-csf（リガンド遺伝子）とそのg-csfr (受容体遺伝子)の発現を、RT-PCR法により解析した。g-csfは後期神経胚期（Stage 19）以降に、g-csfr mRNAは初期神経胚期（Stage 14）以降にメッセージが検出されることがわかった。第二に、G-CSFが胚の一次造血にどのような役割を果たしているかを調べるために、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集技術を利用して、g-csfrの発現阻害実験を行った。g-csfr遺伝子に対して設計されたsgRNAおよびcas9 mRNAを4細胞期の予定背側割球に注入した胚では、尾芽胚期におけるα-globin（赤血球マーカー）の発現が抑制された。一方、mpo（骨髄球マーカー）の発現はある程度抑制されたが、完全に消失した個体は現れなかった。第三に、g-csfr遺伝子の第1エキソンとそれに続くイントロンのジャンクション領域を標的としてMOを作成し、上記と同様に、4細胞期の予定背側割球に注入したところ、多くの個体で尾芽胚期におけるα-globinの発現が強く抑制された。一方、mpoの発現はある程度抑制されたが、部分的な効果であった。
以上の結果から、G-CSFシグナルは、予想された結果とは異なり、顆粒球/マクロファージ系列の分化、増殖に限定されず、赤血球系列を含む原始血球全体の分化、増殖に関わっていることが強く示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H29年度、胚組織の移植実験の結果をまとめた論文が出版されたことで、骨髄球の初期胚における新たな生理機能の解明のための土台が完成した。新たな骨髄球集団の存在の意義（生理学的な役割）を明らかにするため、spib遺伝子の発現阻害実験は必要と考えているが、第一世代のCRISPR/Cas9による変異導入実験は骨髄球の分化に影響を与えなかった。これについては、現在、ターゲット配列を見直した第二世代の変異導入実験を準備している。一方で、g-csfr遺伝子への変異導入実験およびモルフォリノによる発現阻害実験は予想を超えた展開が見られた。様々な実験の結果から、胚発生においてG-CSFシグナルは、これまで知られている顆粒球の分化増殖活性に加え、赤血球の分化に極めて重大な役割があることが明らかとなってきた。このことは、マウスやヒトでこれまで指摘されてきたG-CSFシグナルの血球分化における役割が大きく変更される可能性を示唆している。そこで本研究では、年次計画を一部変更して、G-CSFシグナルの新規機能の発見に関する実験を追加したいと考えている。総合すると、本研究は予定通りに研究が進展していると判断された。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)G-CSFシグナルの胚血球分化における役割：g-csfr遺伝子のターゲット部位をPCRで増幅し、シーケンス解析により変異導入が本当に起こっていることを確かめる。G-CSFシグナルは、赤血球分化のどの段階に必要なのかを調べる。そのためにflk1、gata2、gata1、sclなど前駆細胞に発現する遺伝子を解析する。g-csfr遺伝子（受容体）、g-csf遺伝子（リガンド）の胚発生過程における発現場所を特定する。In situハイブリダイゼーション解析により、受容体とリガンドの局在を明らかにする。また、外胚葉、中胚葉で異なる分布を示すかどうかを調べる。BMPシグナルに依存した発現を示すかどうかを調べる。
(2)初期幼生の中腎原基における骨髄球出現の意義：生後７日の幼生の中腎原基付近に集積する骨髄球の生理学的な意義を明らかにするため、骨髄球特異的転写因子をコードするspib遺伝子への変異導入実験をおこなう。これまでに試みたターゲットに加え、別の候補ターゲット候補に対する変異導入を試みる。骨髄球の分化を阻害することに成功した場合、それらの幼生における赤血球、リンパ球、骨髄球の分布を抗体染色などで確かめる。
(3)後期幼生、成体の肝臓における骨髄球の分布とその存在意義：mpoエンハンサーの支配下でGFPを発現するトランスジェニックガエルの幼生、成体肝臓皮質の組織学標本を作成し、MpoおよびGFPタンパク質発現を抗体二重染色により比較する。肝臓皮質に局在する骨髄球の胚体内起源を明らかにする。
以上の実験から、幼生の造血器官への局在が新たに明らかにされたMpo陽性細胞（骨髄球）の存在状況、および生理的な意義の解明に近づくとともに、腹部血島における赤血球分化におけるG-CSFシグナルの役割に関する研究を新たに展開していく。
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| Causes of Carryover |
３月中に購入を予定していた消耗品の一部は、実験の都合上H30年度に注文することになった。
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