2018 Fiscal Year Research-status Report
幹細胞を活用した転写制御因子群による感覚器形成機構の研究
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16K07370
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
内川 昌則 大阪大学, 生命機能研究科, 助教 (80346147)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Sall4 / Sox因子 / 感覚器原基 / 内耳 / 転写制御因子群 / エンハンサー / 胚発生 / 細胞分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
感覚器原基(耳、眼、鼻)が、共通原基である頭部外胚葉から特異化される機構の解明とその機構を駆使した感覚器細胞のプログラミングを目的として研究してきた。本研究では、転写制御因子群「SOX転写因子とそのパートナー因子」の機能に着目した。
本年度は、内耳におけるSOX因子とSall4による協調的な転写制御について解析した。これまで解析してきたニワトリNOP1/2エンハンサー、Otic1エンハンサーの配列を、Avian phylogenomics projectの鳥類45種の情報や、NCBIにおける爬虫類ゲノムを含む脊椎動物の配列を用いて詳細に比較した。その結果、NOP1/2, Otic1エンハンサーのSOX因子とSall4結合配列のコンセンサス配列を決定できた。今後、これら転写制御因子群の標的配列を探索する際に有用な情報になると考えられる。
In vivoにおけるSOX因子とSall4による協調的なDNA配列への結合を示すために、Proximity Ligation Assay (PLA)を行うことを計画している。そのための各転写因子への抗体を検討した。しかしニワトリ胚でSall4を確実に検出できるマウスモノクローナル抗体が見つからず、PLAで必要な抗体の組合せを揃えることができなかった。今後もさらに市販品の抗体を調査するとともに、オリジナルの抗体作成も検討する。
SOX因子とSall4の標的配列をin vivoで明らかにするため、DamID法を用いる。またin vivoで組織特異的な遺伝子発現プロファイルを作成するためにTRAP (Translating Ribosome Affinity Purification)法を行う。これらの方法を用いることで、in vitroではなくin vivoで解析できる可能性がある。そのための準備を始めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度の研究では、in vivoにおけるSOX因子とSall4の役割を明らかにしようとした。特にニワトリ胚を用いて、SOX因子とSall4の協調的な相互作用を明らかにしようとしたが、今のところうまくいっていない。ニワトリ胚でも使用可能な抗体を引き続き探したいと考えている。
これまで培養細胞を用いて、SOX因子とそのパートナー因子Sall4などの標的遺伝子を明らかにしようと計画していた。しかし、これまでの解析からニワトリの胚組織を用いて、in vivoで解析できる可能性が出てきた。そのための準備で少し時間がかかったため、転写制御因子群SOX因子とそのパートナー因子の標的遺伝子の同定までできていないが、ほぼその準備も終了した。今後実際にそれらの標的配列を同定していきたいと考えている。
また今年度は、一部実験室の閉鎖に伴う片付けが必要となり、その作業に思った以上に時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
予算の繰越し請求を行ったので、計画はやや遅れているが、今後も計画にそって推進する。
これまでの解析から、in vivoでSOX因子とそのパートナー因子による標的遺伝子を同定する。感覚器原基のそれぞれの組織で時期・領域特異的にDam methylaseを発現させ、目的の転写因子の標的配列を同定するが、そのベクターのコンストラクションはほぼ終了した。現在、そのベクターを用いて予備実験を行い、実際にin vivoで発現させたDamがうまく機能するかどうか確認している。
in vivoで組織特異的な遺伝子発現プロファイルを作成するためにTRAP法を用いるが、こちらも必要なベクターのコンストラクションがほぼ全てそろった。これまで行ったChIP解析を参考に、Ribosomeのサブユニットに融合したGFPに対する抗体を用いて、免疫沈降を行う。これまでの実績を活かして、in vivoで時期・組織特異的な遺伝子発現の解析を行う。
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| Causes of Carryover |
本年度は、旅費以外は概ね予定通り使用した。旅費については、今年度は研究の遅れもあり参加できなかったが、次年度、国際学会も含め、重要な学会があるので参加したい。また国内学会にも招待されているものがあるので、参加予定である。
一部実験の遅れによって、予算の繰越し申請を行った。今年度、その計画通りに使用する予定である。消耗品などの物品費と配列決定のための委託実験費に使用していく予定である。
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