2016 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
16K07376
|
|---|
| Research Institution | University of Hyogo |
|---|
Principal Investigator |
梅園 良彦 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (20391881)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | FGFシグナル |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
初年度は、アッセイ系の構築に専念した。具体的には、アフリカツメガエル胚を活用し、アフリカツメガエルconstitutive active FGFR1の２量体形成ドメインと、キナーゼドメインを持つプラナリア真FGF受容体(DjFGFR1およびDjFGFR2)のIgドメインおよびキナーゼドメインを欠くプラナリア偽FGF受容体(NDK、NDL-2およびNDL-3)のIgドメインとを入れ換えたキメラ受容体をコードするcDNAを作製し、そのmRNAとDjfgf mRNAをアフリカツメガエル受精卵に共注入し、アニマルキャップを用いてアフリカツメガエルFGFシグナルの標的遺伝子であるXbraの発現誘導能を定量RT-PCR法により解析することによって、それぞれの受容体のIgドメインとDjFGFとの相互作用の有無を評価するものである。これまでに、まずはDjFGFR1、NDL-2およびNDL-3のキメラ受容体cDNAを作製し、アッセイに用いてきた。その結果、予想外にもキメラ受容体はすべて単体で、濃度依存的にXbraの発現誘導ができること、また、この解析には、想像以上の実験精度が必要であることなど、様々な問題に直面したため、アッセイ系の構築には多くの時間を要する結果となった。最終的には、現在までにNDL-2はDjFGFと強い相互作用を示すこと、一方で、NDL-3はDjFGFとの相互作用が検出できないことがわかってきた。これらについて、引き続き実験を継続しており、統計的に優位な結果が得られるまでの安定的な技術の確立を目指している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度はアッセイ系の構築に専念したが、当初の想像をはるかに超えて、非常に困難であることが判明した。具体的には、アニマルキャップを切り出す過程において、内在のXbraの発現をある程度持ち込んでしまうため、個体間で非常に厳密に同じくアニマルキャップを切り出す必要があった。また、顕微注入の仕方およびそもそもアフリカツメガエル個体間においても遺伝子発現における感受性が全く異なることが判明し、安定した結果が得られるまでに想像以上の時間を費やす結果となった。これらすべての要因を１つ１つ検討するために１名の技術補佐員を雇用し、安定した技術をもって実験をおこなうことによって、ようやく特定の受容体のIgドメインとDjFGFとの相互作用が検出できるようになってきている。今後も、この技術補佐員を継続して雇用し、安定したアッセイ系の構築を完成させる予定である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は、アッセイ系の完成をめざすとともに、まずは初年度の計画であったDjFGFR1、DjFGFR2およびNDKのIgドメインとDjFGFとの相互作用の有無を調べる。これらの結果をもとに、平成２９年度の研究計画に従い実験を遂行する予定である。
|
| Causes of Carryover |
アッセイ系の構築に想像以上の時間を要したため、初年度当初に計画していた実験をすべておこなうことができなかったため、実験に要する消耗品代の一部が残ってしまった。しかしながら、最終的にはアッセイ系の構築がほぼできた状態にあるので、実験の遅れは次年度に取り戻すことが可能であると判断している。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
DjFGFR2およびNDKのキメラ受容体をコードするcDNAの作製および、これらを用いてアフリカツメガエル胚によるDjFGFとの相互作用の有無を構築したアッセイ系により調べる。次年度使用額はこれら実験に要する試薬などの消耗品代に充当し、翌年度分に請求した助成金は当初の計画どおりに使用する予定である。
|
