2018 Fiscal Year Research-status Report
メダカ突然変異体群の解析による始原生殖細胞の移動を制御する新しい分子機構の解明
| Project/Area Number |
16K07381
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Gakugei University |
|---|
Principal Investigator |
笹土 隆雄 東京学芸大学, 教育学部, 研究員 (90511204)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-10-21 – 2020-03-31
|
| Keywords | 始原生殖細胞 / 細胞移動 / ケモカイン / ヒト疾患関連遺伝子 / ヒト遺伝疾患 / 疾患モデル動物 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
2018(H30)年度においてはメダカの飼育環境の整備を更に進め、ホールマウントin situハイブリダイゼーション解析・変異体作製や、初期胚解析に用いる孵化酵素の作製に必要な野生型を十分量産生出来る安定した環境を構築した。始原生殖細胞の移動に異常が見られる２種のメダカ突然変異体（kamigamo, shimogamo）について、これまでの遺伝学的な解析により、それぞれヒトに奇形を生じさせる先天性小児疾患の原因として知られる転写調節因子であることを突き止めているが、その原因遺伝子cDNAのクローニング、及び、配列の解読を進め、始原生殖細胞の移動期胚における発現解析（ホールマウントin situハイブリダイゼーション）の為のプローブを現在作製している。更に、先の大規模な変異体表現型スクリーニングにおいて検出したshimogamo変異は１つのみであった為に、相補性検定による遺伝学的な確認を行う為に、CRISPR/Cas9システムを用いたノックアウトメダカの作製に取りかかっている。同時に、shimogamo遺伝子についてはそれを一つしか持たない哺乳類とは異なり、メダカを含む小型魚類においてはパラログがもう一つ存在する。そこで、この遺伝子も始原生殖細胞の移動に関わっているのかどうかを確認する為に、CRISPR/Cas9システムによりshimogamoパラログのノックアウトメダカの作製にも取りかかっている。更に、shimogamoパラログの発現解析に用いる為のホールマウントin situハイブリダイゼーション解析を進めるために、cDNAのクローニング、及び、配列の解読を進め、プローブの作製を進めている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
研究代表者の所属の異動に伴う飼育環境・実験環境のセットアップや研究体制の再構築に引き続き時間がかかり、当初の計画よりも遅れが生じている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
昨年度に引き続き、始原生殖細胞の移動に異常が見られ、かつその原因遺伝子がそれぞれヒト遺伝疾患に関る転写調節因子として知られる２種のメダカ突然変異体（kamigamo, shimogamo）について、以下の解析を行う。なお課題進捗の遅れについては、小型魚類の遺伝学的解析の専門家を２名程当初計画よりも増やし、これら研究者等との打ち合わせを頻繁に行って協力を得ながら、挽回に務める。更に、外部企業による業務委託サービス等を適宜有効に用いて進捗の改善を図る。
・CRISPR/Cas9システムを用いてshimogamoノックアウトメダカを作製し、先の大規模変異体スクリーニングにおいて得られたshimogamo変異との相補性試験を行う。
・CRISPR/Cas9システムを用いてshimogamoパラログのノックアウトメダカを作製し、この遺伝子が始原生殖細胞の移動に関わっているのかどうかを調べる。
・始原生殖細胞の移動期において、shimogamoおよびそのパラログやkamigamo遺伝子が発現している組織を、ホールマウントin situ ハイブリダイゼーションによって調べる。
・転写調節因子と考えられるkamigamo、及び、shimogamoが、既知のケモカイン関連遺伝子の発現制御に関わっているのかどうかを調べる。つまり、これまでに始原生殖細胞の移動への関与が知られている既知のケモカインとその受容体遺伝子、cxcl12a/sdf1a、cxcl12b/sdf1b、cxcr4b、cxcr7等について、各変異体胚におけるそれぞれの遺伝子の発現を、ホールマウントin situハイブリダイゼーションによって調べる。
|
| Causes of Carryover |
（理由）
研究代表者の所属の異動に伴う飼育環境・実験環境のセットアップや研究体制の再構築に引き続き時間がかかり、当初の計画よりも遅れが生じている。その為、計画していた実験の一部を繰り越し、その経費を次年度に引き続いて使用することとした。
（使用計画）
次年度は進捗の遅れを挽回する為に、研究体制を見直し、当初計画よりも新たに２名の共同研究者を加えて研究を実施する。その為、「次年度使用額」については、これら研究者等との打ち合わせ旅費等に充てる。更に、前年度より持ち越した実験に必要な試薬・消耗品費として使用する。同時に、これまでに引き続き、動物の飼育環境や研究環境の再構築、及び、その充実の為に使用する。更に、課題進捗の効率化を図る為に、適宜外部企業による業務委託サービス等を利用する経費として用いる。
|
