2016 Fiscal Year Research-status Report
テンションウッド誘導系を用いたG層形成のマスター制御因子の探索
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16K07402
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
久保 稔 奈良先端科学技術大学院大学, 研究推進機構, 特任准教授 (30342778)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | テンションウッド / 細胞壁 / G層 / 網羅的遺伝子発現解析 / ポプラ / 次世代シーケンシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
テンションウッド形成を効率よく再現しかつ様々な過程において観察可能な実験系を構築するために、無菌的にポット栽培した交雑ポプラの挿し木苗をポットごと傾斜させ、テンションウッドを形成させる実験系を構築した。この実験系では、テンションウッド形成の特徴である、幹の屈曲、木部の偏心成長、G層形成が再現よくかつ同調的に観察されることがわかった。
この系を用いてテンションウッド形成過程における網羅的遺伝子発現解析を実施するため、傾斜後のポプラ挿し木苗の屈曲部から基部におけるテンションウッド形成側（TW）と同じ樹齢の傾斜させていないポプラの木部を継時的にサンプリングし、RNA抽出後、cDNAライブラリーの作成を行い、次世代シークエンサーを用いた網羅的遺伝子発現解析（RNA-seq）を行った。
上記で得られたRNA-seqデータを用いて統計的解析を行った結果、発現変動を示す1881個の遺伝子を検出した。次にこれらを用いて多変量解析の一つである階層クラスタリングを行ったところ、傾斜後4-21日目にかけてテンションウッドで特異的に発現上昇を示す580個の遺伝子を見いだすことができた。さらにこれらの遺伝子について類似性の高い遺伝子を探索し、それらの配列情報から得られる遺伝子機能の推定やジーンオントロジー（GO）解析を行ったところ、テンションウッドマスター制御因子の候補となり得る33個の転写因子を同定することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度においては以下の研究を中心に行った。
1）ポプラ挿し木苗のテンションウッド形成過程における網羅的遺伝子発現解析
無菌的にポット栽培した交雑ポプラ（T89）の挿し木苗をポットごと傾斜させ、テンションウッド形成過程について幹の横断面・縦断面の観察を行った。その結果、傾斜後12時間で茎の屈曲が観察され、傾斜後4日目から屈曲部から基部にかけて幹の上面側の木部において、一様に偏心成長が観察された。さらに、傾斜後21日目以降ではテンションウッドの特徴であるG層形成が観察された。傾斜後0、4、7、14、21日目のポプラ挿し木苗のテンションウッド形成側(TW)木部と傾斜させていないポプラ木部のサンプルから RNA を抽出し、cDNA ライブラリーを作成後、 次世代シークエンサーを用いた網羅的遺伝子発現解析を行った結果、1881個の発現変動を示す遺伝子を検出した。これらを用いて階層クラスタリングを行ったところ、9つのクラスタの内、クラスタ１、クラスタ４、クラスタ７において、傾斜後4-21日目にかけてテンションウッドで特異的に発現上昇を示す遺伝子群を見いだすことができた。これらのクラスタにおいてはそれぞれ109、238，233遺伝子が含まれており、さらにそれぞれ10個、12個、11個の転写因子を同定することができた。
2）培養細胞における木部繊維細胞分化誘導系の構築
ポプラ種であるギンドロの培養細胞の継代培養を開始した。当初この培養細胞を用いて木部繊維細胞誘導系を構築し、そこに上記の解析で得られたG層形成のマスター制御因子の候補を導入する予定であったが、ギンドロ培養細胞における形質転換系の確立が未だできていないことから、木部繊維細胞分化誘導系の構築やG層形成のマスター制御因子の機能解析がより確実で簡便なアッセイ系の検討を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
以下の研究を順次遂行する。
1）木部繊維細胞分化誘導系の構築：木部繊維細胞分化誘導系を構築するために、繊維細胞形成のマスター制御因子SND1/NST3 のオーソログである PtVNS11の cDNAを用いて、デキサメタゾン(DEX) 依存的に遺伝子機能を活性化することができる PtVNS11-GR 融合タンパク質を発現させるコンストラクトを作成し、従来から計画しているギンドロの培養細胞以外に交雑ポプラとベンサミアナタバコを用いた二つの実験系の構築を試みる。
2）テンションウッドマーカー株の作成：H28年度に見出したテンションウッド特異的発現遺伝子の配列情報を基に、公開されているポプラ種 コットンウッド(Populus trichocarpa)のゲノム情報から、プロモーター配列を抽出し、GUS や GFP 等のレポーター遺伝子をつないだコンストラクトを作成する。これらを交雑ポプラ T89 株に形質転換し、ポプラ挿し木苗のテンションウッド形成時における発現パターンを観察する。
3）G層形成のマスター制御因子の探索：１）で作成した木部繊維細胞誘導系において、H28年度に見出したテンションウッド特異的発現遺伝子をエストロゲン発現誘導ベクターに導入し、交雑ポプラT89株に形質転換し、エストロゲン依存的にテンションウッド以外の木部にG層が形成されるかを観察する。
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| Causes of Carryover |
当初計画していたギンドロ培養細胞を用いた木部繊維細胞分化誘導系の構築について、形質転換体の作成や導入遺伝子の機能解析のし易さを検討した結果、交雑ポプラやベンサミアナタバコを用いた木部繊維細胞分化誘導系の構築を進める方が今後の研究計画の達成に貢献できると考え、培養試薬・器具類、分子生物学関連試薬・器具類の一部を次年度使用に繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
木部繊維細胞分化誘導系を構築するために、繊維細胞形成のマスター制御因子SND1/NST3 のオーソログである PtVNS11の cDNAを用いて、デキサメタゾン(DEX) 依存的に遺伝子機能を活性化することができる PtVNS11-GR 融合タンパク質を発現させるコンストラクトを作成し、従来から計画しているギンドロの培養細胞に加えて、交雑ポプラとベンサミアナタバコを用いた二つの木部繊維細胞分化誘導系の構築を行う。
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