2016 Fiscal Year Research-status Report
植物細胞の分裂と伸長を同時に調節する微小管制御系の解明
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16K07406
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| Research Institution | Miyagi University |
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Principal Investigator |
日渡 祐二 宮城大学, 食産業学部, 准教授 (10373193)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 良勝 名古屋大学, トランスフォーマティブ生命分子研究所, 特任講師 (30414014)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 細胞伸長 / 先端成長 / 細胞分裂 / 細胞質分裂 / フラグモプラスト / キネシン / 微小管 / ライブイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物の形態形成は細胞骨格制御系による細胞分裂と細胞伸長の調節を介して制御される。この際，微小管の制御因子は，細胞分裂と細胞伸長の場に適切に移動し，機能する中心的な役割を担っている。微小管制御因子がどのように分裂と伸長の場に移動するのかは不明な点が多い。そこで，分裂と伸長を同時に制御するキネシンKINID1をモデル系として，制御因子の移動メカニズムを解析している。今年度は，KINID1タンパク質のターンオーバーを明らかにするために，光変換蛍光タンパク質Dendra2を融合させたKINID1aを発現する安定形質転換系統を作出した。この系統を用いて，細胞質分裂と伸長でのDendra2融合KINID1a（KINID1a-Dendra2）タンパク質のターンオーバー解析を行った。KINID1a-Dendra2タンパク質の光変換イメージングは研究分担者とともに名古屋大ITbMの共焦点レーザー走査型顕微鏡LSM780を用いた。細胞質分裂では，フラグモプラスト微小管が細胞中央部から周縁部に拡大するが，光変換したKINID1a-Dendra2タンパク質はフラグモプラスト微小管の拡大に伴い細胞周縁部への移動が観察された。細胞伸長では微小管束が2-3分の寿命で周期的に形成されるが，光変換したKINID1-Dendra2タンパク質は伸長領域に1時間以上検出された。従って，KINID1-Dendra2タンパク質は形成と消失を繰り返す微小管束よりも安定に存在し，微小管束の形成に繰り返し機能することが示唆される。KINID1タンパク質の移動メカニズムについて，KINID1-Dendra2タンパク質とEB1タンパク質が共局在するため，EB1が相互作用因子の候補として考えられた。酵母2ハイブリット系を用いてEB1タンパク質とKINID1aタンパク質の相互作用を検討したが，この系では相互作用が検出されなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
タンパク質レベルの移動メカニズム解析は概ね順調に進んでいる。一方，mRNAレベルでの移動については，(a) RNAアプタマーを用いたmRNAライブイメージング方法，および(b) mRNAの3’UTRにstem-loop構造のタグを付加し，このタグに特異的に結合するGFPを発現させる方法ともに，mRNAイメージングするための発現コンストラクトの作製が遅れているため，まだmRNAのイメージング系の確立には至っていない。また，KINID1 mRNAの移動メカニズムの解析では，さまざまな領域からなる5’ UTRを連結させたKINID1を発現させる計画であったが， 5’ UTRを含むmRNAを発現させるコンストラクトの作製が遅れたため，5’ UTRのどの領域がmRNAの移動に機能するかは未解析である。現在，完成したコンストラクトを順次，植物体に遺伝子導入している。
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| Strategy for Future Research Activity |
KINID1タンパク質移動については，以下の2点に注力する。(1) KINID1-Dendra2タンパク質のターンオーバーの定量的解析を行い，移動のカイネティクスを明らかにする。(2)アミノ酸領域を欠失させた変異型KINID1-GFP融合タンパク質を発現させることにより，タンパク質移動に関わるアミノ酸領域のモチーフまたはドメインを特定する。これらの変異型KINID1-GFP融合タンパク質を発現するコンストラクトの作製を速やかに行い，変異型KINID1-GFPを発現する形質転換体を作製する。この結果をもとに，KINID1タンパク質の相互作用因子を免疫沈降とMS解析により同定する。また，この方法の補完するアプローチとして，酵母2ハイブリット系によるライブラリースクリーニングを行う。この場合には，ヒメツリガネゴケのライブラリーの使用に加えて，陸上植物での普遍性を検討するためにシロイヌナズナのライブラリーを用いたスクリーニングも考慮し，ヒメツリガネゴケとシロイヌナズナの結果を比較しながら相互作用因子の同定を行う。
KINID1 mRNAの移動については，次の2点のアプローチに注力する。(1)さまざまな領域の5’ UTRを連結したKINID1 mRNAを発現させる形質転換体を作出する。5’ UTRの関与が認められる場合には，5’ UTR中のシスエレメントの同定を行う。(2)RNAイメージングについては，まず(a) RNAアプタマーを用いたmRNAライブイメージング方法と(b) mRNAの3’UTRにstem-loop構造のタグを付加し，このタグに特異的に結合するGFPを発現させる方法に用いるコンストラクトを作製し，mRNAのイメージング系を確立することに注力する。
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