2016 Fiscal Year Research-status Report
ステロイド膜受容体の機能・構造解析を中心とした卵成熟・排卵誘導機構の解明
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16K07419
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
徳元 俊伸 静岡大学, 理学部, 教授 (30273163)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ステロイド膜受容体 / 卵成熟 / 排卵 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでステロイド膜受容体（mPR）が卵成熟誘起ホルモンの受容体であることをモルフォリノアンチセンスオリゴによるノックダウン実験等により示してきた。しかし、膜受容体の機能については相反する報告もなされ、世界的な議論にあることから遺伝子変異メダカを樹立することで生理機能の証明を目指す。一方、新技術である排卵誘導法を用いて排卵誘導に必要な遺伝子群の同定を目指す。
本年度はこれまで樹立したメダカゲノム中に存在する4種類のmPRの遺伝子変異メダカ系統の4重の変異体の系統樹立を進めると伴に、遺伝子編集技術であるCRISPR/Cas9システムにより確実な機能欠失系統の樹立を始めた。
人工合成に成功したmPRタンパク質については結晶化に向けた精製法の改良を進めた。
ステロイドホルモンや内分泌かく乱物質を飼育水に直接に添加し、サカナの生体そのものに作用させる新しい手法を確立した。この手法により排卵誘導の鍵遺伝子の探索を進めている。これまでmRNA発現レベルの解析はマイクロアレイを使用して行ってきた。しかし、マイクロアレイ解析では偽陽性がみられる他、配列情報の不正確さの問題があり、その後のリアルタイムPCRによる各遺伝子の発現解析との不一致が見られた。ところが平成26,27年度とゲノム支援プロジェクトに採択され、ゲノムシークエンサーによるRNA-seqによる解析が実施できた。RNA-seqの場合はシークエンスデータとともにその遺伝子の発現量の変動が調べられることからより正確なデータが得られる。本研究では27年度分のRNA-seqのデータを含めて候補遺伝子を選択し、リアルタイムPCRによる発現変動の確認を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は特にインビボ卵成熟・排卵誘導法による排卵誘導遺伝子の同定の項目で進展が見られた。マイクロアレイ法による排卵誘導遺伝子候補のリストアップの結果を論文として公表できた。また、RNA-seq法によりリストアップした候補遺伝子も含め、ゲノム編集技術による機能解析を開始できた。一部の遺伝子については遺伝子破壊系統の樹立に成功している。ノックアウトメダカについても系統の樹立は順調に進み、3重変異体は得られているものの特に異常は見られない。4重変異体の樹立を開始している。mPRタンパク質の大量合成についても主要設備であるタンパク質精製装置の導入により効率的に進められるようになったが、構造解析のためにはさらなるスケールアップが必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ノックアウトメダカの4重変異体系統の樹立を進めると同時にCRISPR/Cas9法によるゲノム編集技術による機能解析も同時に進める。同手法は排卵誘導遺伝子の解析においてゼブラフィッシュでは導入に成功している。非常に高い確率で遺伝子破壊に成功していることからメダカにおいても短期間での成功が期待される。排卵誘導遺伝子候補については引き続きゲノム編集系統の作出を進め、排卵誘導の鍵遺伝子の解明を目指す。mPRタンパク質の大量合成についてはカラムクロマトグラフィー法にさらに改良を加えてスケールアップを試みる。
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