2016 Fiscal Year Research-status Report
基部植物ヒメツリガネゴケの生物時計解析―時計機能の多様化原理の理解に向けて
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16K07447
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
青木 摂之 名古屋大学, 情報科学研究科, 准教授 (30283469)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 生物時計 / ヒメツリガネゴケ / 二成分制御系 / ヒスチジンキナーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
基部植物のモデル種ヒメツリガネゴケを用い、生物時計の分子機構について次のように研究を進めた。
１、概日ヒスチジンキナーゼ候補遺伝子の解析 シロイヌナズナの時計タンパク質Pseudo-Response Regulators（AtPRRs）のコケホモログPpPRRsは、被リン酸化配列のDDKモチフを有し、またin vitroでリン酸転移の基質となるので、AtPRRsとは違い、二成分制御系の真性レスポンスレギュレーターであると考えられる。そこでPpPRRsにリン酸転移するヒスチジンキナーゼ（HK）の候補として、植物の系統上でコケ型PRR配列群と分布が重なるHKのコケホモログ、HK3aとHK3bをコードする遺伝子の解析を行なった。まずHK3a、HK3b両遺伝子について、相同組換えによる遺伝子破壊を施し、それぞれの一重変異株と両者をともに欠いた二重変異株を作出した。野生型株と比べ、これらの変異株では、１）茎葉体の発生が明暗サイクル条件特異的に促進され、２）AP2タイプの茎葉体発生制御因子APB遺伝子群の転写活性が上昇することを明らかにした。いっぽうで各種植物ホルモンに対する感受性を野生型株と変異株の間で比べたが、現在のところ違いは見つかっていない。
２、コケ細胞を用いた一過的な概日遺伝子発現アッセイ法の条件検討 パーティクルガンを用いたコケ原糸体コロニーへのレポーターコンストラクトの撃ち込みによる、遺伝子発現の概日リズムの一過的測定の条件検討を行い、従来の測定結果よりも斉一性・再現性に勝る条件を確立した。
１で、茎葉体の発生が明暗サイクル特異的に促進された事から、HK3aとHK3bが生物時計の制御に関わる可能性は高いと考えられた。これらの因子を今後さらに解析する事で、生物時計の新たな入出力経路に関する知見が得られ、さらに植物の生物時計の進化に関する理解が進むと期待出来る。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、いまも原始的な特徴を残す基部植物の一種ヒメツリガネゴケの生物時計を解析する事によって、１）生物時計の中核回路の解明；２）概日リン酸リレー系の同定と機能解析；３）発振機構の推定；の３つを行う事である。「研究実績の概要」２に記した、パーティクルガンを用いた概日遺伝子発現の一過的アッセイ法の改良は、特定遺伝子の時計機能の有無の検証と、時計遺伝子間の制御関係の解析のうえで、今後非常に役に立つと期待出来る成果である。また「概要」１に記したHK3aとHK3bの解析結果からは、これら二つの因子が、コケのPpPRRタンパク質群へのリン酸化において機能する（陸上植物では新規の）ヒスチジンキナーゼである可能性を示唆している。今後、これらの因子が実際にコケのPRRと（恐らくは仲介因子のHPtを介して）相互作用し、リン酸を転移するかどうかを各種の方法で検証する必要がある。そのための準備が整ったという意味において、研究計画全体の推進にとって意義深い成果であると評価出来る。これらの理由により、現在までの進捗状況として（２）を選択した。一方で、発振機構の推定については、解析中の概日二成分制御系がA）入出力経路の一部であり中核回路の外部に位置するのか、それともB）中核回路の一部に組込まれているのかによって、シナリオが大きく変わってくる。この点を研究期間完了時までにどの程度進める事が出来るかが、研究全体の進捗評価にとって大きな要因の1つになると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、現在解析中のヒスチジンキナーゼHK3aとHK3bが実際にリン酸リレーによりPpPRRsにシグナルを送る因子であるのかどうかを綿密に検証する必要がある。そのために、１）酵母２ハイブリッドシステム（Y2H）や共免疫沈降に基づく生化学的方法などによる相互作用解析と、２）リン酸化によるPpPRRsの（ウェスタン解析での）バンドシフトがHK3a/HK3b変異株でどう変化するかを知るための解析を行なう予定である。Y2Hは現在準備中で、既にHK3a/3bとPpPRRsのcDNAを組込んだプレイ/ベイトプラスミドは構築済である。一方で、概日二成分制御系においてリン酸リレー介在因子として働くHPtの候補はまだ絞れていない。しかし、ゲノム配列中に見つかるコケのHPt候補遺伝子は６前後と少なく、問題なく総当たりで調べる事が出来ると考えている。一部のHPtのcDNAについては、プレイ／ベイトプラスミドへの組込みを始めている。さらに、HK3a/HK3bが生物時計に入力する制御因子である可能性を検証するうえでは、両者の変異株における生物時計の位相や周期を野生型株と比較する事が重要である。これは今後行なって行くが、そのうえで上記の一過的な概日遺伝子発現アッセイの改良法を大いに活用して行く予定である。なお、高等植物との間で共有される中核回路の制御過程については、現在までにCCA1ホモログ遺伝子の破壊株を用いた解析結果などを得てはいるが、未解析の部分もあるので、今年度の後半から来年度の前半にかけて、LUXホモログの遺伝子破壊等をはじめとして、力を入れて行く計画である。
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[Presentation] Circadian Clock in the Moss Physcomitrella patens2017
Author(s)
Ryo Masashi, Santosh B. Satbhai, Yuki Goto, Kensuke Sato, Ryo Okada, Takashi Yamashino, Takuya Matsuo, Mizuho Ichinose, Mamoru Sugita and Setsuyuki Aoki
Organizer
Circadian Clock of Cyanobacteria during 1991-2017
Place of Presentation
Nagoya University, Sakata-Hirata Hall, Nagoya.
Year and Date
2017-03-12 – 2017-03-12
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