2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K07455
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
小野 教夫 国立研究開発法人理化学研究所, 平野染色体ダイナミクス研究室, 専任研究員 (20291172)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | コンデンシンII / 染色体軸 / クロマチン / 再組織化 / HEATリピート / 機械学習 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コンデンシンIとIIは分裂期染色体の構築において中心的な役割をもつタンパク質複合体であり、姉妹染色分体の縦軸に集中して局在する。この軸状構造には、コンデンシンとともにトポイソメラーゼIIα(トポII)も集中する。しかし、この軸状構造(染色体軸)の形成機構や染色体構築にどのような貢献をしているのかはよく分かっていない。
そこで申請者らはカバーガラス上のHeLa細胞を直接バッファーで処理して染色体の構造を可逆的に変換する実験系を確立した(sodium chloride-induced chromosome conversion [SCC] assay)。この実験系では低塩濃度下でMg2+をキレートすることで大きく膨潤したクロマチンと染色体軸（ステップ1）を、次に処理するバッファーのNaCl濃度を変化させることで、特徴的な形態に変換することかができる(ステップ2)。ステップ2で生理的塩濃度に近い100 mM NaClで処理すると、クロマチンは元の分裂期染色体に近い形態に回復し、コンデンシンIとII、トポIIによる軸構造が再組織化される。
本研究ではこのSCC assayとsiRNA knockdownを組み合わせて、クロマチンと染色体軸の可逆的再組織化におけるコンデンシンIとII、およびトポIIの役割を検討した。その結果、100 mM NaCl処理によるクロマチン形態の適切な回復はコンデンシンIIの軸の再組織化と密接に関連していた一方で、コンデンシンIの軸はクロマチンの再組織化への貢献は低かった。さらに、トポIIはクロマチン形態の回復と染色体軸の再組織化に殆ど貢献していなかった。これらの結論は機械学習による染色体形態の定量的解析によって確認された。これらの結果から、染色体構築においてコンデンシンIIによる染色体軸の形成とクロマチンの組織化は密接に関与していることが強く示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究における到達目標は以下の3つである。（１）染色体の再組織化におけるコンデンシン、トポII およびコヒーシンの役割を明らかにすること。（２）再組織化されたクロマチン構造の特徴を見いだし、それが細胞周期各ステージでどのように変化するのかを明らかにすること。（３）染色体形態変化の定量的解析法を確立するとともに、再組織化における染色体軸の分子特性を明らかにすること。昨年度までに、（１）の目標は達成された。今年度は主に（３）の目標において、機械学習(wndchrm: weighted neighbor distances using a compound hierarchy of algorithms representing morphology)をもちいた染色体クロマチンの解析方法を共同研究によって確立した。これによって、SCCアッセイにおける各ステップでのクロマチン形態の変化を客観的に示す事が可能となり、染色体軸とクロマチンの形態の回復におけるコンデンシンIIの貢献を、定量的に確認することができた。さらに、これらの成果をまとめ、Mol Biol Cell, 28:2875-2886 (2017)として論文発表した。したがって、本研究は当初の計画以上に進展していると判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究により、コンデンシンIIによる染色体軸の再組織化はクロマチン形態の回復と密接に関連していることが示された。次年度は、（１）回復したクロマチンの詳細な構造および染色体軸の再組織化の分子メカニズムと、（２）細胞周期各ステージにおけるクロマチンの再組織化とコンデンシンの役割の解明を進める。
（１）このSCCアッセイで回復したクロマチンのヒストン修飾パターンや、セントロメアの構造を免疫染色によって明らかにしていく。この実験により、コンデンシンIIによる軸がどのようなクロマチン構造を回復させるのかを詳細に解析する。また、コンデンシン複合体にはHEATリピートを持つサブユニットが2つ含まれることから、コンデンシンIIの軸への集合には、HEATリピートを介した疎水的な相互作用が関連している可能性もある。この仮説の検証のため、両親媒性の溶媒を用いて疎水的環境を撹乱した条件での再組織化を解析する。
（２）一方、分裂期染色体のクロマチンと染色体軸の回復・再組織化においてはトポIIとコヒーシンの貢献は見いだされなかった。これらの因子は間期から核内に局在することから、SCC assayを間期核に適用して、これらの因子やコンデンシンIIを除去したときのクロマチンの変化を解析する。本実験では、細胞内のタンパク質を迅速に分解できるauxin inducible degradationシステムを導入し、コンデンシンを特定の細胞周期ステージで除去できる実験系を確立することを目指す。これは、これまでのsiRNAノックダウンではコンデンシンを充分に除去するまでに数日を要し、その間に通過する分裂期での染色体分離異常が次の間期に与える影響を完全に取り除くためである。
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| Causes of Carryover |
本計画ではSCCアッセイの条件検討とコンデンシンの役割を迅速に行うことができたため、実際に使用する培養器具や試薬、siRNAオリゴや免疫染色に使用 する抗体が当初計画よりも少なかった。今後は新しいコンデンシン分解システムも構築するため、そのセットアップのための費用とする。特に間期細胞の解析では特定の細胞周期ステージに同調することが必要となり、そのための試薬と条件検討に用いる計画である。
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