2018 Fiscal Year Research-status Report

In vitro DNA複製系を用いたリピート不安定性メカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	16K07457
Research Institution	National Hospital Organization, Kyushu Cancer Center
Principal Investigator	織田信弥独立行政法人国立病院機構(九州がんセンター臨床研究センター), その他部局等, 腫瘍遺伝学研究室長 (40333372)
Project Period (FY)	2016-10-21 – 2020-03-31
Keywords	リピート配列 / DNA複製 / DNAポリメラーゼ / 複製エラー / マイクロサテライト不安定性 / ゲノム不安定性 / リピート病
Outline of Annual Research Achievements	短タンデムリピート(short tandem repeat, STR)は、DNA 複製の際にエラーが頻発する複製困難な配列であるにもかかわらず、真核生物ゲノム上に夥しい数が分布する。STR の生理機能は不明だが、その変化が一部のヒトがんや神経・筋疾患の病因となる。STR の変化の実態とその分子機序の解明が待たれるが、これまでの実際にin vivoで生じたリピート変化を帰納的に観察する研究には限界があった。本研究では、はじめてin vitro DNA 複製系を用い、リピートの普遍的な変化の動態をin vitro で観察し、変化を規定する分子要因を演繹的に明らかにすることを目的とした。初年度の計画(第1ステップ)はまず、複製型ポリメラーゼはどのようにリピート配列を複製するのか、1) 複製効率の変化と要因、2) 複製エラーの発生頻度と要因をin vitroで明らかにすることを目標とした。この目的に必要なさまざま性質のリピート配列をもつM13由来環状2本鎖DNA基質の作成に交付決定後すぐさま着手したが、進捗が遅れていた。昨年度、連携研究者と議論を重ね、さまざまなアッセイの基質として応用可能な統合型多目的2本鎖環状DNA基質をpBluescriptを雛型にその配列を多地点で改変することにより作成した。すでに合成と調製を終えていたが、今年度は基質の構造を検証し、使用可能であることを確認した。今後この基質を用いたgap-filling assay系を構築することで、研究の進捗が期待される。一方、第2ステップで予定した課題(リピート不安定性につながる分子異常の同定)として、ヒト疾患で見出されたDNAミスマッチ修復遺伝子変異をゲノム編集技術により導入したヒト細胞で、マイクロサテライト配列の変化を観察したところ、一般にヒト腫瘍でみられる変化と異なる変化が生じることを見出し、その解析結果を公表した(Hayashida G et al. Exp Cell Res 377: 24-35, 2019)。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 初年度の計画(第1ステップ)はまず、複製型ポリメラーゼはどのようにリピート配列を複製するのか、1) 複製効率の変化と要因、2) 複製エラーの発生頻度と要因をin vitroで明らかにすることを目標とした。この目的に必要なさまざま性質のリピート配列をもつM13由来環状2本鎖DNA基質の作成に交付決定後すぐさま着手したが、進捗が遅れていた。昨年度、連携研究者と議論を重ね、さまざまなアッセイの基質として応用可能な統合型多目的2本鎖環状DNA基質をpBluescriptを雛型にその配列を多地点で改変することにより作成した。すでに合成と調製を終え、今年度は基質の構造を検証し、使用可能であることを確認したが、本年度は研究以外の業務が多忙を極め、期間中これ以上研究をすすめることができなかった。このため、年度末、期間延長承認申請を提出し、今年度までの延長が認められている。今後作成した基質を用いて、早急にgap-filling assay系を構築し、研究をすすめる予定である。
Strategy for Future Research Activity	今回作成した統合型多目的2本鎖環状DNA基質にさまざま性質のリピート配列をサブクローニングすることで基質を至急完成させ、これを用いたgap-filling assay系を構築、集中的にアッセイを行っていきたい。
Causes of Carryover	M13由来環状2本鎖DNA基質の作成に交付決定後すぐさま着手したが、諸般の理由から進捗が遅れていた。昨年度、統合型多目的2本鎖環状DNA基質の合成と調製を終えていたが、これを用いたアッセイはまだ実施できておらず、試薬その他の消耗品の使用が少なく、残額が生じた。今後この基質を用いたアッセイ系を構築し、アッセイを多数実施することで、研究の進捗が期待される。