イネのＰＡＬ遺伝子ファミリーの機能解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07553
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 寺石 政義 京都大学, 農学研究科, 講師 (80378819)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥本 裕 京都大学, 農学研究科, 教授 (90152438) ; 森 直樹 京都大学, 農学研究科, 教授 (30293913)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: イネ / 発現タンパク質 / βアミノ酸

Outline of Annual Research Achievements

植物が産出する二次代謝物の中には、病原菌や害虫に対する防御機能をもつものが多い。これらを活用すれば、植物自らがもつ自己防御機構を高めることができ、病虫害の被害を抑えることができる。我々は、ＰＡＬ(フェニルアラニンアンモニアリアーゼ)様配列の一つがβチロシンの合成酵素をであることを、植物で初めて明らかにし、βチロシンに他感作用があることを明らかにした。ＰＡＬ様配列は，PALの他にTAL（チロシンアンモニアリアーゼ），PAM（フェニルアラニンアンモニアムターゼ)およびTAM(チロシンアンモニアムターゼ）として機能していると考えられるが、イネに９個存在するPAL様配列が、それぞれどのような機能を有しているかは未解明である。本研究では、ＰＡＬ様配列の機能を解明するとともに、βチロシンと類似した生合成反応で生じるβフェニルアラニンの合成酵素遺伝子を明らかにすることを目的とする。まず、日本晴からＰＡＬ様配列をＲＴ－ＰＣＲで増幅して，大腸菌発現ベクターに導入したところ，８つのＰＡＬ様配列について発現タンパク質を得ることができた．全て可溶性画分で得られたことから，今後試験管内での合成反応を行う予定である．ＰＡＬ様配列変異体の探索をTOS17ミュータントライブラリーなどＷＥＢで公開されている変異集団を対象に行ったが，該当する変異体を見いだすに至ってない．その代替策としてPCRによるmPingミュータントライブラリーからのスクリーニングを行っている．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

12イネの葉身RNAから逆転写させたｃＤＮＡを用いてPAL様配列を得た。これらを大腸菌発現ベクターに導入し、発現タンパク質を得た。WEB上でデータベース公開されている変異体ライブラリーから、PAL様配列の変異体を探索したが、該当するものを選抜することはできなかった。

Strategy for Future Research Activity

発現タンパク質を使って酵素学的実験を行い、PAL様配列の機能を明らかにする。PCRベースでスクリーニング可能な突然変異集団からPAL様配列の変異体を選抜する。βフェニルアラニン生合成に関わる遺伝子が判明すれば、ノックアウト形質転換体を作成し、機能解明を進めていく。

Causes of Carryover

大腸菌発現タンパク質を用いた酵素学的実験の反応物分析において新規の物質が同定されなかったことにより，既存の試薬で賄うことができ，新たな標品の準備等の経費が発生しなかったため

Expenditure Plan for Carryover Budget

大腸菌発現タンパク質を用いた酵素学的実験に由来する反応物だけでなく，イネ変異体からもタンパク質を抽出して新規分室の同定を試みる