2016 Fiscal Year Research-status Report
分子遺伝情報の育種活用を目指したマーカーフリーの迅速遺伝子編集法
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16K07560
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| Research Institution | Meijo University |
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Principal Investigator |
寺田 理枝 名城大学, 農学部, 教授 (30137799)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 育種学 / 遺伝学 / 遺伝子 / ゲノム / 植物バイオテクノロジ- |
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| Outline of Annual Research Achievements |
新規組換え育種技術の開発と育種の推進を目指し、イネ遺伝子ターゲティング法の技術革新を進める。特に、ポジティブ選抜マーカーとトランスポゾンAc/Dsを組合わせたターゲティングベクターを構築し、相同組換えによる標的遺伝子編集後に継続してAc/Ds脱離誘導によりポジティブ選抜マーカーの自律的削除を行い、1回の形質転換で標的遺伝子の編集と不要配列の削除を行った変異イネを作出できる迅速育種法を確立する。標的遺伝子として耐病性制御のOsRac1GEF1とフロリゲンのRFT1の遺伝子編集を進め、耐病性強化及び種子収量の改良イネ系統の作出を進める。遺伝子ターゲティング編集後のトランスポゾンAc/Ds脱離を介したポジティブマーカー等不要配列の削除システムではAc強化型酵素遺伝子とイネに最適化したコドンによるAcTPase4x遺伝子を用いる。ターゲティング完了後にAc/Ds脱離を誘導するためpLP2及びヒートショック（pHS）それぞれのプロモーター機能をGUS発現検出ベクターにより確認し、Ac/Ds脱離誘導条件と削除頻度のデータを得る。Ac/Ds脱離後の配列を完全に野生型ゲノム配列に戻すため、Ac/Ds脱離配列の隣接塩基配列をあらかじめ相補鎖側の塩基に置換しAc/Ds脱離後配列が野生型ゲノム配列となることを確認する。次いで不要配列を自律的に削除するターゲティング遺伝子編集法の確立を進める。Ac/Ds脱離によるポジティブ選抜マーカー削除システムを組込んだ遺伝子ターゲティング基本ベクターを構築して耐病性制御遺伝子OsRac1GEF1（S549D）変異誘導および花成誘導のフロリゲン遺伝子RFT1 (R63G, R131A)変異誘導を進め、遺伝子編集イネの耐病性、種子収量の変化を解析する。有用系統が得られた場合は、共同研究者と連携して隔離圃場での育成調査の展開や有用系統の実用性評価の準備も検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
遺伝子ターゲティング編集後にポジティブマーカー等不要配列をAc/Ds脱離により自律的に削除するシステムの基本ベクターを構築して、GUS遺伝子を用いてAc/Ds脱離の効率を確認した。イネのコドンに最適化した強化型AcTPase4x遺伝子を構築した。ターゲティング完了後にAcTPase4xを発現誘導するプロモーターの確認を進めた。pLP2 プロモーターは再分化緑化組織で、ヒートショック（pHS）プロモーターは42℃条件及び生殖細胞特異的に活性化される。pLP2、pHSPプロモーター活性化によるAc/Ds脱離で35SプロモーターとGUSPlusが連結し形質転換カルスで青色GUS発色を検出するベクターを構築して形質転換カルスを作成しAc/Ds脱離条件を決定した。さらにAc/Ds脱離後のフットプリントPCRで複数カルス系統の青色部分を統計的に解析した。pHSプロモーターについては形質転換カルスを60分又は90分間、42℃で処理してAc/Ds脱離条件を検討した。この実験ではカルスの褐変化やアルビノ系統も観察されたため、すべての結果をまとめて最適条件を決定した。標的遺伝子編集後にAc/Ds脱離後の痕跡配列を野生型ゲノム配列に完全に戻すため、ターゲティングベクターのAc/Ds配列に隣接する相同組換え配列側の1塩基をあらかじめ相補鎖側の塩基に置換した遺伝子編集ターゲティングベクターを構築した。さらに耐病性制御遺伝子OsRac1GEF1のアミノ酸置換（S549D）配列改変となる相同組換え配列領域を組み込むことで、OsRac1GEF1（S549D）変異誘導および花成誘導のフロリゲン遺伝子RFT1 (R63G, R131A)変異誘導の自律的マーカー削除のターゲティングベクターの構築もすべて完了した。
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| Strategy for Future Research Activity |
OsRac1GEF1変異誘導と自律的マーカー削除のターゲティングを進めるため、金南風品種由来のカルスにOsRac1GEF1変異誘導と自律的マーカー削除型のターゲティングベクターを形質転換する。ポジティブ・ネガティブ選抜後の生存カルスについてPCRおよびDNAシークエンス解析を行い、OsRac1GEF1アミノ酸置換（S549D）の配列改変に成功したターゲティングカルスを選抜する。Ac/Ds脱離の可視化システムのデータより、ターゲティングカルスを再分化して、自律的マーカー削除の誘導組織と再分化を経由させることで、OsRac1GEF1のアミノ酸置換（S549D）配列のみ改変された変異イネをPCRおよびDNAシークエンス解析により確認する。その際にカルスでピンク発色するAsRed2目視マーカーをポジティブマーカーに連結したOsRac1GEF1変異誘導後自律的マーカー削除のターゲティングベクターも構築して、pHSPプロモーターの42℃処理による自律的マーカー削除の追跡をカルスのピンク発色の消失による顕微鏡観察も併用して確認する。Ac/Ds脱離による自律的マーカー削除配列がゲノム上の他領域に再挿入されていないことをPCR解析により確認した上で、T0植物体を誘導する。次いでP1植物育成室にて促成栽培し、自殖を経てT1世代の植物体を展開し、S549D改変ホモ型固定イネを選抜する。OsRacGEF1改変体は、qPCR等により恒常活性型OsRacGEF1の発現を確認した上で、マイクロアレイ解析によりシグナル伝達経路下流の関連遺伝子群の発現変化を確認する。さらに、葉への接種試験により”いもち病”や”紋枯病”等の病原菌に対する抵抗性を評価し、良好な結果が得られた場合は系統として展開する。
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| Causes of Carryover |
研究の進捗状況は計画通りに進んでいる。2年目の実験で実際にターゲティング形質転換と耐病性遺伝子OsRacGEF1へのS549D変異導入とポジティブ選抜マーカー削除の形質転換を行う予定であるが、先行しているCre-loxPシステムでのポジティブ選抜マーカー削除では予想外に削除効率が落ちているため、Ac/Ds脱離によるOsRacGEF1へのS549D変異導入後のポジティブ選抜マーカー削除には、予定より多数のターゲティングカルス系統を確保して研究が速やかに進むように2017年度の消耗品と試薬類を当初の予定より多額に計算したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
OsRacGEF1へのS549D変異導入後のAc/Ds脱離によるポジティブ選抜マーカー削除を行った遺伝子編集系統を多数準備して目的の遺伝子編集イネ系統を確実に得るために、多数のターゲティングカルス系統を確保を目指す目的で、2017年度の消耗品と試薬類を当初の予定より多く購入して、ターゲティング形質転換実験の回数を増加して研究推進を行う。
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[Journal Article] Targeted base editing in rRice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion2017
Author(s)
Shimatani Z.,Kashojiya S., Takayama M., Terada R., Arazoe T., Ishii H., Teramura H., Yamamoto T., Komatsu H,, Miura K., Ezura H., Nishida K., Ariizumi T.and Kondo A.
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Journal Title
NATURE BIOTECHNOLOGY
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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