倍数性が異なる組織を利用したヒュウガナツ非還元配偶子の遺伝的構成の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07600
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 本勝 千歳 宮崎大学, 農学部, 准教授 (30381057)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: カンキツ / 倍数性 / 非還元花粉 / 果樹

Outline of Annual Research Achievements

本研究はヒュウガナツの枝変わり品種‘西内小夏’にみられる非還元花粉形成の過程・メカニズムに関する知見を得るために，個体内で倍数性が異なる組織におけるDNAマーカー（SNPマーカー）の遺伝様式をもとに推察しようとするものである．本研究ではそのための新たな解析方法を考案し，本年度はその確立に向けた‘西内小夏’，ハッサクにおけるSNPマーカーの探索および選抜を行い，‘西内小夏’受粉果における種子成長の経時的観察を行った．
SNPマーカーの遺伝様式を診るために，‘西内小夏’においてヘテロ接合になっているSNPマーカーが必要である．また，減数分裂時に遺伝的組換えが生じないことが望ましい．以上のことから，まず公表されている同じカンキツ属植物であるクレメンティンの遺伝地図情報を基にセントロメアに近接すると考えられる20の遺伝子座を選択した．次に，Phytozomeデータベースによりその配列情報を取得してプライマーを設計し，‘西内小夏’およびハッサクにおけるSNP遺伝子型情報をダイレクトシークエンスにより調査した．その結果，20遺伝子座のうち，16遺伝子座においてシークエンス情報が得られ，その中の5遺伝子座において計15箇所のヘテロ接合性SNPが確認された．
次に，遺伝解析に使用するためのサンプルを獲得するために，‘西内小夏’の自家受粉及びヒュウガナツב西内小夏’の受粉を各200花ずつ行い，経時的に果実を採取して，中に含まれる正常種子の胚の発育および胚乳（内種皮）の形成について調査し，あわせて胚の発芽性について調査した．その結果，10月以降に採取した種子について，胚の発芽が正常に行なわれる事を確認した．一方で内種皮組織についても調査開始時より確認できたものの試行的にDNA抽出を行ったが抽出できず，採取時期及び抽出方法についてはさらに検討が必要と思われた．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画に記載したマーカー選抜については行ったが，実生におけるジェノタイピングとキャリブレーションについては現在行っているところであり，その点からはやや遅れている．しかしながら，ジェノタイピングについては現在シークエンス解析を行っており，また，平成29年度以降の実験計画に記載している胚の分離と回収についても，試行的にフローサイトメトリー分析やDNA抽出の検討など既にその一部を行っていることから，全体の研究計画からみれば，おおむね順調に進行しているものと判断した．

Strategy for Future Research Activity

今年度はH28年度の研究において選抜されたマーカーを用いた解析方法を確立する予定である．すなわち，現在行っているヒュウガナツ×ハッサクの実生を用いた遺伝子型解析によって，選抜したSNPマーカーのホモ個体を同定し，サンプル内の対立遺伝子の量比を二次元平面上に反映できるかをqRT-PCRシステムを用いて確認する．検出用の手法として，研究計画に記載されたTaqManプローブの使用に加えて，ユニバーサル配列により解析の低コスト化が期待できるAmplifluorシステムの導入を検討する．内種皮からのDNA抽出については前年度の試行結果より課題が残っているが，抽出方法およびサンプリング時期をさらに検討し，抽出を行えるようにしたいと考えている．

Causes of Carryover

予算執行は99.9%行っており，次年度使用額が発生した理由は，予算消化のための無駄な調整を行わなかったためである．

Expenditure Plan for Carryover Budget

H29年度配分額と合わせて，必要物品の購入に充てる．