シンクロトロン放射光による病原性および非病原性ポリガラクツロナーゼの立体構造解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07619
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 中村 正幸 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 准教授 (90404475)
• Project Period (FY): 2016-10-21 – 2019-03-31
• Keywords: ポリガラクツロナーゼ / タンパク質発現

Outline of Annual Research Achievements

平成28年度は、まず既にポリガラクツロナーゼ(PG)の外分泌発現系に成功している酵母を用い、タンパク質の精製を試みた。しかしながら、発現タンパク質の量が少なかったことから、タンパク質の結晶化には適していないことが分かった。そこで、大腸菌を用いた内分泌系によるPG発現系の構築を試みた。大腸菌には、BL21(DE3)を、プラスミドにはpET-23bを用いた。その結果、病原性PG(S31PG1)の発現は可溶性、不溶性共に認められず、非病原性PG(S63PG1)は、封入体の形成が認められた。発現の認められなかったS31PG1については、HisタグをC末端側からN末端側に付け換えたことで、封入体の形成が認められた。いずれのタンパク質も封入体は得られたことから、不溶性タンパク質を用いてリフォールディングを行った。リフォールディングは、不溶性タンパク質に6M塩酸グアニジン水溶液(50mM リン酸緩衝液、50mM DTT、pH7.0)を少量ずつ加え、一晩静置後、リフォールディング緩衝液(L-cysteine or cystine in 50mM リン酸緩衝液, pH7.0)で希釈して行った。その結果、S31PG1は、5mM L-cysteine in 50mM リン酸緩衝液 (pH7.0)と5mM L-cystine in 50mM リン酸緩衝液 (pH7.0)を用いて4℃、10倍希釈で活性のあるタンパク質を得ることができた。一方、S63PG1は、0.5mM L-cysteine in 50mM リン酸緩衝液 (pH7.0)と0.5mM L-cystine in 50mM リン酸緩衝液 (pH7.0)を用いて、30℃、10倍希釈の条件で活性のあるタンパク質を得ることができた。このように条件が大きくことなることからも、両タンパク質の構造と性質に大きな違いがあることが予想された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

病原性PGと非病原性PGの性質が異なるため、それぞれに条件を検討する必要があり、予想以上に活性のあるタンパク質を得るのに時間がかかった。また、本課題が追加採用であったため、実験のスタートが遅くなったことも理由である。

Strategy for Future Research Activity

今回の実験では発現したタンパク質が封入体であったため、リフォールディングにより可溶化タンパク質を得たが、タンパク質の結晶化を行うためには、さらに適したリフォールディング条件を検討する必要がある。また、同時に、大腸菌の系統を変え、S-S結合を促進するようなT7 Shuffleやorigamiなどを用いることや発現ベクターも可溶化を促すトリガーを付加するようなもの(pCold Pros2など)を用いることで結晶化に向け、可溶化タンパク質を体量に得ることも検討したい。

Causes of Carryover

キャンペーン中の消耗品等があり少々余った。

Expenditure Plan for Carryover Budget

残金は僅かなため、翌年度必要な試薬等に使用する。