2016 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
16K07622
|
|---|
| Research Institution | Nihon University |
|---|
Principal Investigator |
井村 喜之 日本大学, 生物資源科学部, 准教授 (50366621)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 抵抗性 / ウィルス / 植物 / 遺伝子機能 / 複製 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ズッキーニ黄斑モザイクウイルス(ZYMV)に対するキュウリの抵抗性は、単一の劣性因子によって支配されている。ゲノムマッピングにより、劣性抵抗性遺伝子の候補としてVps4をコードする遺伝子を特定した。ウイルス抵抗性キュウリであるA192-18由来のVps4遺伝子は、タンパク質－タンパク質相互作用に関与するとされるドメイン内に２箇所のアミノ酸置換を伴う変異が生じていた。そこで平成28年度の計画に従い、この変異とウイルスに対する表現型との関連性を明らかにすべく、ウイルスに罹病性を示すキュウリ10品種のVps4 cDNAの塩基配列を解析した。その結果、すべての罹病性品種は、2本の染色体ともに変異がない優性ホモ、あるいは一方の染色体のみに変異が認められるヘテロタイプであることが判明した。2本の染色体ともに変異が生じた劣性ホモは強度の抵抗性（免疫性）を示すA192-18のみであった。
次に、Vps4遺伝子の変異とウイルスに対する抵抗性との関係を調べることとした。A192-18由来の変異型Vps4 cDNAを、ZYMVゲノムRNAから合成した感染性cDNAの内部に組み込んだ後、罹病性キュウリ子葉に導入した。これはZYMVが侵入した細胞内で変異したVps4を過剰発現させる、ドミナントネガティブ効果を狙った実験である。ZYMV cDNAのみのコントロール区では、導入後10日目で本葉に明瞭な黄化モザイク症状が確認されたのに対して、変異Vps4 cDNAを組み込んだZYMV cDNAは、導入後10日以上経過しても病徴は現れなかった。定量PCRによっても、変異Vps4の発現によりウイルス量が顕著に低減することが判明した。一方、変異のないVps4 cDNAを組み込んだZYMV cDNAを導入した場合、ウイルスの異常な増殖により多数の壊死斑点が確認された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
ポティウイルスに対するキュウリの劣性抵抗性遺伝子の候補として、タンパク質の液胞輸送に関わるVps4をコードする遺伝子に着目した。平成28年度の研究により抵抗性キュウリA192-18に見られるVps4遺伝子の変異は劣性ホモであり、本実験に用いたすべての罹病性キュウリは優性ホモ、もしくはヘテロの遺伝型を有していたことを明らかにし、この結果から本遺伝子が劣性抵抗性遺伝子であることが強く示唆された。本研究の第一目的は劣性抵抗性を支配する遺伝子を複数の候補から特定することであり、この点において重要な知見が得られたものと言える。次に、ウイルス複製・増殖とVps4の関係性を明らかにするための機能解析において、抵抗性キュウリ由来の変異型Vps4の発現がドミナントネガティブ作用により、罹病性キュウリにおいてウイルスの蓄積量を劇的に低減させ、病徴が発現しなくなることが判明した。加えて、変異のないVps4の罹病性キュウリにおける過剰発現がウイルスの異常な増殖を引き起こし、多数の壊死斑点を形成することも明らかにした。これらの結果は、罹病性由来のVps4がウイルス増殖を助長する一方、抵抗性由来の変異型Vps4はウイルスが自身の複製に利用できないことを意味しており、平成28年度の研究目標である「Vps4がウイルス抵抗性の決定因子であることを特定する」を達成できたと言える。
さらに、平成29年度の研究計画である「Vps4遺伝子の人為的な変異導入によるウイルス増殖への関与」についても、既に上述と同様のドミナントネガティブ作用による実験を遂行している。これまでに得られた結果では、２箇所の塩基配列の相違のうち１箇所の変異のみによって、罹病性キュウリにおけるウイルス蓄積量が有意に低下することを明らかにしている。すなわち、Vps4遺伝子の１塩基の違いがウイルスに対する抵抗性と罹病性を決定づけていると考えられる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度の研究成果により、当初の計画通り、Vps4がウイルス抵抗性を決定づける劣性因子であることを明らかにした。さらに、本遺伝子の１塩基の変異によりウイルスに対して抵抗化することも判明した。そこで、平成29年度ではVps4がどのようなメカニズムによりウイルスの複製・増殖を助長させるかの解明に取り組む。方法としては、Vps4タンパク質と相互作用するウイルスタンパク質を酵母ツーハイブリッド法により特定する。また、ウイルスが感染した植物葉からのcDNAライブラリーを作製し、Vps4タンパク質と相互作用する宿主タンパク質を上述と同様の手法により単離することを計画している。抵抗性キュウリ由来のVps4遺伝子は、タンパク質－タンパク質相互作用に関与するドメイン内に２箇所の変異が見られ、そのうちの１塩基のみの違いによりウイルスが自身の複製に利用できないものと考えれる。そこで、Vps4と相互作用するタンパク質の中から、１塩基の変異を導入したVps4には相互作用しないタンパク質をスクリーニングする。また、Vps4タンパク質に対する抗体を用いた共免疫沈降法により、ウイルス感染した罹病葉においてVps4タンパク質を含むタンパク質複合体をインタクトな状態で沈降させる。同様に、変異導入したVps4をウイルスとともに導入した罹病性キュウリからもタンパク質複合体を回収する。沈降したタンパク質群をSDS-PAGEにて展開し、変異導入の有無によるタンパク質のバンドパターンを比較する。両者で違いが見られたタンパク質のバンドを回収した後、プロテインシーケンサーを用いてアミノ酸配列を解読し、ウイルスの複製・増殖に関わるタンパク質を特定することを計画している。これにより、Vps4を中心としたウイルスの複製・増殖のメカニズムおよび１塩基の変異による抵抗化のシステムを解明できるものと期待される。
|
