2017 Fiscal Year Research-status Report
RNA複製酵素活性を阻害するペプチドによる植物ウイルス増殖抑制技術
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16K07623
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| Research Institution | Meiji University |
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Principal Investigator |
桑田 茂 明治大学, 農学部, 専任教授 (20328967)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大里 修一 明治大学, 農学部, 専任講師 (30533228)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | RNA複製酵素 / RNA切断酵素 / RNA編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度は，植物ウイルス複製酵素複合体を標的としてタンパク質-タンパク質間相互作用(PPI)阻害活性をもつ人工ペプチド配列をランダムペプチドライブラリーから酵母ツーハイブリッド系を用いて取得した．本年度は，標的のキュウリモザイクウイルス１aタンパク質のMTドメインに結合する２種類のペプチド，２aタンパク質のPol領域とNTP結合領域に結合するそれぞれ2種類と９種類について，baitとpreyを交換して結合能を検定したが，両者間の結合が見られないことからbaitのDNA結合領域ドメインと融合した複製酵素ドメインがpreyの人工ペプチドと転写活性ドメイン融合タンパク質間での結合が考えられた．複製酵素ドメイン単独では取得された人工ペプチドと結合しない可能性が高いことが判明した．そこで，複製酵素結合による抵抗性付与の戦略を転換して，ウイルスゲノムの複製酵素遺伝子をRNAレベルで切断することで抵抗性付与の新たな戦略を構築することを目標とした．そのため，最近注目されているRNA切断活性をもつことが報告されたクラス２タイプ４のCasタンパク質を利用したRNAゲノム編集を利用することとして植物で利用可能なCRISPR/C2c2システムを構築することとした．そこで，真正細菌Leptotricchia shahiiのC2c2遺伝子配列(cas13a)の全長をDNA合成し，アグロバクテリウムバイナリーベクターにクローン化し，さらにcrRNA転写用にシロイヌナズナU6プロモータを付加して，植物用のCRISPR/C2c2システムを構築した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ペプチド-ペプチド間相互作用では，人工ペプチドによるRNA複製酵素ドメインに結合により，複製酵素活性を阻害することが困難であったため，直接複製酵素遺伝子を切断することを目標とした．そのためにCRISPR/C2c2システムを構築することとして，植物形質転換用にバイナリーベクター系を構築することに成功した．
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| Strategy for Future Research Activity |
今回，構築に成功したCRISPR/C2c2システムの有用性を示すために，アルファルファモザイクウイルスやキュリモザイクウイルスの配列をターゲットとするcrRNAを組み込んだバイナリーベクターで形質転換体やアグロインフィルトレーション法でRNA切断活性の検証を行い，新規のRNAウイルス抵抗性付与戦略を構築し，対象ウイルスを増やしてゆく予定である．
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| Causes of Carryover |
人工ペプチド単独では複製酵素ドメインに結合性がないことから，アルファースクリーニング実験が不必要となったために経費が少なくなった。その経費の一部で人工遺伝子を合成したため。
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[Journal Article] Increased metabolite production by deletion of an HDA1-type histone deacetylase in the phytopathogenic fungi, Magnaporthe oryzae (Pyricularia oryzae) and Fusarium asiaticum.2017
Author(s)
2.Maeda K., Izawa M., Nakajima Y., Jin Q., Hirose T., Nakamura T., Koshino H., Kanamaru K., Ohsato S., Kamakura T., Kobayashi T., Yoshida M., Kimura M.
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Journal Title
Lett. Appl. Microbiol.
Volume: 65
Pages: 446-452
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Identification of a trichothecene production inhibitor by chemical array and library screening using trichodiene synthase as a target protein.2017
Author(s)
3.Maeda K., Nakajima Y., Motoyama T., Kondoh Y., Kawamura T., Kanamaru K., Ohsato S., Nishiuchi T., Yoshida M., Osada H., Kobayashi T., Kimura M.
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Journal Title
Pestic. Biochem. Physiol
Volume: 138
Pages: 1-7
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Functional analysis of RecQ helicase MUSN in Pyricularia oryzae,2017
Author(s)
1.Kana Kiguchi, Toshiki Tanaka, Takayuki Arazoe, Tetsushi Sakuma, Takashi Yamamoto, Sigeru Kuwata, Shuichi Ohsato,
Organizer
Asian Conference on Plant Pathology, Korea, International Convention Center, Jeju (ICC Jeju)
Int'l Joint Research
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